Research Article

Journal of Agricultural, Life and Environmental Sciences. 31 December 2021. 379-390
https://doi.org/10.22698/jales.20210038

ABSTRACT


MAIN

  • 서 론

  • 재료 및 방법

  •   실험재료

  •   실험동물 및 비만 유도

  •   체중 및 식이효율 측정

  •   장기 및 지방 조직 무게 측정

  •   비만 모델 동물의 혈청 중 지질 생화학적 분석

  •   지방조직 관찰

  •   항비만 효과에 의한 동물조직 유전자 발현 분석

  •   통계분석

  • 결과 및 고찰

  •   체중 변화 및 식이효율

  •   장기 및 지방조직 무게

  •   비만모델 동물의 혈장 중 지질생화학적 분석

  •   지방 세포 크기 변화

  •   Adipogenesis 및 Lipogenesis 전사인자 발현 조사

  •   AMPK 신호 경로의 활성화

서 론

비만이란, 신체 에너지의 섭취와 소모의 불균형으로 발생되는 과도한 에너지가 체지방으로 축적되어 나타나는 상태로(Kopelman, 2000) 최근 들어 전반적인 신체활동 감소, 동물성 포화지방 섭취 증가 등의 영향으로 비만 발병이 급격히 증가하고 있으며, 비만의 원인으로는 생활환경의 변화와 서구화된 식습관, 내분비 장애, 유전적 요인 등을 들 수 있다(Musso et al., 2010). 또한 비만은 비만 자체로도 심각한 문제가 되지만 고혈압, 제 2형 당뇨, 고지혈증, 관절염 등과 같은 만성 퇴행성 질환을 유발하는 주요 원인으로 알려지면서 심각한 질환으로 인식되고 있다(Albu et al.,1997; Grundy, 1998; Visscher and Seidell 2001; Leung et al.,2003; Haslam and James 2005). 이러한 비만 인구의 증가는 차후 사회적, 경제적으로 심각한 문제를 야기할 가능성이 높으므로 비만을 효과적으로 관리하는 것이 중요하다(Freedman et al., 1997). 최근 건강에 대한 관심이 증가하면서 비만의 발생원인, 치료 및 예방법 등에 관한 많은 보고들이 제시되고 있으며(Wada and Ikeda, 1998), 비만을 치료하기 위해서는 약물요법 뿐만 아니라 식이요법, 운동요법들을 병행하게 되면 좋은 효과를 나타내며, 그 중에서도 식이요법은 비만의 예방과 치료를 하는데 있어 가장 중요하고 근본적인 방법이라고 알려져 있다(King and Devaney, 1988). 비만의 예방과 치료를 위한 일환으로 의약품이나 천연물에 대한 연구가 활발히 수행되고 있으며(Choi et al., 2007), 흑마늘 열수추출물이 지방세포의 분화과정에서 중요한 역할을 하는 adipogeneic transcription factor의 발현을 효과적으로 억제하며 lipid droplet 및 triglyceride 생성을 효과적으로 억제시켜 지방세포로의 분화를 막는 항비만 효능을 가질 수 있음을 확인하였으며(Park et al., 2011), 후박 추출물이 지방 세포로의 분화에 관여하는 유전인자를 억제하여 분화를 억제하며, HSL(Hormone sensitive lipase) 발현의 증가로 인해 성숙된 지방세포가 생성한 triglyceride의 분해를 촉진하여 항비만 효과를 나타낸다고 보고하였다(Kim et al., 2009).

십자화과에 속하는 채소류 중의 하나인 갓(leaf mustard, Brassica juncea)은 한국과 일본 등에서 널리 재배되고 있으며, 주로 잎과 줄기를 식용으로 사용하고 종자는 겨자를 만드는데 사용하는 두해살이 식물이다(Farrell,1998). 갓에 함유되어 있는 flavonoid, polyphenol류, 함황화합물들은 들은 생리활성 물질로서 체내에서 약리작용을 나타내는데, 특히 면역계를 강화시킴으로써 건강유지에 기여하며, 최근에는 암을 예방하는 대표적인 식품으로 여겨지고 있다(Lee and Rhee, 1997). 유용물질의 추출이 용이하고, 색이나 향기 등의 파괴를 줄이는 소재의 미세분말은 물질 표면적을 최대화하여 용해도를 높여 식품 및 바이오산업에서 활용도가 증진되는 장점을 가지고 있으며, 분말의 분쇄 중 저온을 유지함으로써 색감과 향기를 최대한 유지시켜 주는 장점이 있어 미세 분말을 활용한 음료의 경우, 목 넘김, 복용 편이성, 건강기능성이 강조됨으로써 판매가 지속적으로 상승하고 있다(Park et al., 1996).

미세 분말화 기술 개발은 용해도 증진을 통해 체내 흡수율을 높이는 기능성 식품소재나 식의약 소재 등 고부가가치 소재로의 전환이 가능 할 것으로 기대된다(Kim et al., 2002; Jung and Lee, 2007).

따라서 본 연구에서는 고지방식이로 비만이 유도된 쥐에 공기분급 갓 분말 추출물의 항비만 효과와 기전을 관찰하여 소비자들의 건강증진을 위한 고부가가치 건강기능식품 소재화시 기초를 제공하고자 하였다.

재료 및 방법

실험재료

2019년에 정선에서 재배된 갓을 농업회사법인 유미웰빙스(주) (Yeosu, Korea)로부터 건조한 시료를 구입하였다. 건조 갓을 미세분쇄/분급 처리하기 전, 분쇄 효율을 높이고자 MS-200 분쇄기(Myeongseong Co. Ltd, Chengju, Korea)를 사용하여 조분쇄 한 후 열풍건조기로 60°C에서 8시간 재건조를 실시하였다. 건조된 조분쇄물은 Soro-100N 미세분쇄/분급기(Sorobio Co. Ltd, Jeonju, Korea)를 이용하여 4,200 RPM으로 갓 미세분쇄/분급을 실시하여 sinigrin 고함유 갓 분말을 제조하였으며 함량은 22.77 mg/g 이었다. 항비만활성에 사용한 갓 추출물은 분쇄한 분말에 20배의 50% EtOH 용액을 첨가한 후 70°C에서 2시간 동안 추출한 후 추출액을 여과한 후 감압농축(CCA-1100, Eyela, Tokyo, Japan)하여 -70°C에서 급속동결건조(PVTFA 10AT, ILSIN, Korea)과정을 거쳐 분말 상태로 실험에 사용하였다.

실험동물 및 비만 유도

실험동물로 5주령의 C57BL/6J 계열 mice를 ㈜중앙실험동물(Central Lab - Animal Inc., Seoul, Korea)에서 구입하여 1주일간 사육실에서 적응시킨 후 실험에 사용하였다. 실험동물 식이로는 정상식이군에게 총 칼로리의 10%가 지방인 정상식이(NFD; 10% kcal fat; Adjusted Calories Diet, Envigo, No. TD.06416)를 공급하였고, 비만 유도를 위해 고지방식이군에는 총 칼로리의 60%가 지방인 고지방식이(HFD; 60% kcal fat; Adjusted Calories Diet, Envigo, No. TD.06414)를 공급하였다. 적응 기간 후 실험동물은 난괴법으로 각 군당 8마리씩(n = 8) 총 6군으로 분류하고 정상식이군을 제외한 모든 군은 고지방식이로 2주간 비만을 유도하였으며, 정상식이군(NFD), 고지방식이군(HFD), 고지방식 + 갓 추출물 50 mg/kg/day 투여군(BJ50), 고지방식 + 갓 추출물 100 mg/kg/day 투여군(BJ100), 고지방식 + 갓 추출물 200 mg/kg/day 투여군(BJ200), 고지방식 + Garcinia cambogia 추출물 100 mg/kg/day 투여한 양성대조군(GC100)으로 총 6군이며, 비만 유도 후 모든 추출물을 증류수에 용해하여 1일 1회씩 8주간 경구 투여하였다. 동물 사육실의 온도 및 습도는 24 ± 5°C, 55 ± 5%로 설정하였으며 lighting cycle은 12시간 주기로 자동 조설하였다. 동물실험은 한림대학교 실험동물 운영위원회 및 동물실험윤리 위원회의 승인을 받아 실시하였다(승인번호: Hallym 2021-11).

체중 및 식이효율 측정

실험 기간에 실험동물이 자유롭게 물과 식이를 섭취하도록 하였고, 주 1회 체중을 측정하였다. 섭취한 식이량은 전주에 공급한 식이량과 남은 식이량의 차이로 계산하였으며, 식이 효율(food efficiency ratio; FER)은 주간 동물 체중 증가량을 섭취한 식이량으로 나누어 산출하였다.

FER (%) = body weight change (g/day)/food intake (g/day) × 100

장기 및 지방 조직 무게 측정

실험동물의 장기조직[신장, 비장 및 지방조직(부고환지방 및 내장지방)]은 채혈 후 즉시 적출하여 PBS(phosphatebuffered saline) 용액으로 수차례 헹군 후 표면의 수분을 제거하여 칭량하였으며, 즉시 액체질소로 급냉시켜 –70°C에 보관하였다.

비만 모델 동물의 혈청 중 지질 생화학적 분석

시료를 8주간 투여 후 사육이 끝난 실험동물은 12시간 절식시킨 후 2,2,2-tribromoethanol(Sigma Aldrich)와 2-methyl-2-buthanol(Sigma Aldrich)에 의해 마취시켜 혈액을 채취하였으며 12,000 g, 4°C에서 10분간 원심분리 후 혈청을 분리하였다. 분석 전까지 혈청은 -70°C에 보관하였으며 각 실험동물로부터 분리한 혈청(serum)에서 간 기능의 지표인 alanine aminotransferase(ALT) 및 aspartate aminotransferase(AST)의 분석과 혈청 지질함량의 지표인 total cholesterol(TC), high-density lipoprotein cholesterol(HDL-C), low-density lipoprotein cholesterol(LDL-C), triglyceride(TG) 함량을 clinical chemistry analyzer(Konelab 20XT; Thermo Fisher Scientific, Inc.)를 사용하여 분석하였다.

지방조직 관찰

부고환 지방조직을 4% paraformaldehyde 용액에 48시간 고정한 후 증류수로 수세하고, tissue processor(TP1020; Leica Biosystems, Nussloch, Germany)를 사용하여 60% alcohol부터 상승 농도로 탈수한 다음 파라핀 포맷한 후 이를 6 µm 두께로 절편하여 슬라이드를 제작하고 hematoxylin & eosin(H & E) 염색한 다음 광학현미경(ECLIPSE Ni-U; Nikon)으로 지방조직 세포를 관찰하였다.

항비만 효과에 의한 동물조직 유전자 발현 분석

부고환 지방조직에 RIPA buffer(Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA)를 첨가하고 균질화하여 4°C에서 14,000 g으로 10분간 원심분리하여 상등액을 얻어 BCA protein assay kit로 단백질을 정량하였음. 단백질 10 µg은 4X sample buffer와 혼합하여 95°C에 5분간 가열하고, 10-12% SDS-PAGE로 100 V, 90분간 단백질을 크기대로 분리하였음. 그 후 SDS-PAGE를 Semi-dry transfer system을 이용하여 12-15 V, 60분간 PVDF membrane에 단백질을 전이시켜 Blocking buffer(5% Skim mlik in 1 X TBST)에 1시간 이상 반응하고, primary antibody로 β-actin, PPARγ, C/EBPα, SREBP-1c, adiponectin, AMPK, p-AMPK(Cell Signaling Technology, Danvers, Massachusetts, USA)을 각각 4°C에서 overnight 반응시킨 후 1 X TBST로 7분 간격으로 3번 반복 washing함. Secondary antibody인 goat anti-rabbit IgG(Cell Signaling Technology, Danvers, Massachusetts, USA)을 실온에서 1시간 이상 반응시킨 후, 1 X TBST로 7분 간격으로 3번 washing 하였고, ECL reagent로 발색한 후 X-ray film에 형광을 감광하였으며, 밴드의 음영 면적은 Image J를 이용하여 수치화 하였다.

통계분석

본 실험에서 얻은 결과는 평균 ± 표준편차(mean ± S.D.)로 나타냈으며, 통계처리는 SPSS 25.0, Statistical Package for Social Science Inc., USA)를 이용하여 일원 변량분석(One way ANOVA)을 실시한 후 Duncan's multiple range test로 유의성을 p < 0.05 수준에서 검증하였다.

결과 및 고찰

체중 변화 및 식이효율

정상식이군(NFD), 고지방식이군(HFD), 고지방식 + BJ 추출물 50 mg/kg/day 투여군(BJ50), 고지방식 + BJ 추출물 100 mg/kg/day 투여군(BJ100), 고지방식 + BJ 추출물 200 mg/kg/day 투여군(BJ200), 고지방식 + Garcinia cambogia 추출물 100 mg/kg/day 투여한 양성대조군(GC100)에 대해 8 주간 경구 투여 후 식이효율 및 체중변화를 확인 하였다. 실험이 실시되는 8 주 동안에 HFD-BJ에서 각 개체의 건강상태는 양호하였다. 실험동물의 초기 체중은 평균 21.60 g이었고 군 간에 유의한 차이를 확인할 수 없었다. Initial body weight는 각 군별로 유의한 차이가 없었으나(p > 0.05), final body weight는 통계적으로 유의한 차이가 나타내었다(p < 0.05). HFD군은 NFD군에 비해 체중이 1.49배 증가한 반면, 추출물 BJ100 및 BJ200 투여군은 HFD군에 비하여 체중이 유의적으로 낮았으나(p < 0.05), 두 군간의 농도 의존성은 나타나지 않았다(p > 0.05)(Fig. 1, Table 1).

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Fig. 1.

Effects of treatment with different concentrations of Brassica juncea L. (BJ) extract on body weight in high-fat diet (HFD)-induced obese C57BL/6J mice. Values are expressed as mean ± standard deviation (SD; n = 8). Different lowercase alphabets indicate that differences between means were considered statistically significant when p < 0.05. Aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT), total cholesterol (TC), glucose (GLU), high-density lipoprotein (HDL-C), low-density lipoprotein (LDL-C), triglyceride (TG). Normal diet-fed mouse group: NFD (10% fat); high-fat diet-induced obese mouse groups: HFD (60% fat) BJ 50/100/200, where HFD-induced obese mice were orally treated with BJ extract at 50/100/200 mg/kg/day, respectively. GC100 HFD-induced obese mice were orally treated with Garcinia cambogia water extract at 100 mg/kg/day.

Table 1.

Effects of treatment with different concentrations of Brassica juncea L. (BJ) extract on body weight in high-fat diet-induced obese C57BL/6J mice

Group Parameters (g)
Initial body weight Final body weight Body weight gain
NFD 21.68 ± 0.70a 30.87 ± 1.09d 9.19 ± 1.30d
HFD 21.62 ± 0.79a 46.18 ± 2.11a 24.55 ± 1.94a
GC100 21.38 ± 0.73a 41.31 ± 2.48c 19.93 ± 2.94c
BJ50 21.73 ± 0.76a 45.11 ± 2.63ab 23.38 ± 2.48ab
BJ100 21.57 ± 0.60a 42.80 ± 3.17bc 21.23 ± 3.30bc
BJ200 21.59 ± 0.60a 40.66 ± 2.72c 19.07 ± 2.62c

Values are expressed as the mean ± SD (n = 8). Different lowercase alphabets indicate that differences between means were considered statistically significant when p < 0.05. NFD, normal diet mice group (10% fat); HFD, high-fat (60% fat) diet-induced obese mice group; BJ 50/100/200, high-fat diet-induced obese mice were orally treated with BJ extract at concentrations of 50/100/200 mg/kg/day; GC100, high-fat diet-induced obese mice were orally treated with Garcinia cambogia water extract at concentrations of 100 mg/kg/day.

식이 섭취량, 에너지 섭취량 및 식이 효율의 결과는 Table 2에 나타내었다. 식이 급여 8주 동안의 식이 섭취량은 각 군별로 유의한 차이가 없었으나(p > 0.05) 에너지 섭취량은 고지방식이를 공급한 모든 군에서 유의적으로 높게 나타났다(p < 0.05). 이에 따라 식이 효율도 고지방식이를 공급한 모든 군이 NFD군보다 유의하게 높게 나타났으며(p < 0.05), 추출물 투여군 중 BJ200을 투여한 군의 식이효율(FER)만 HFD군에 비해 유의적으로 낮게 나타났다(p < 0.05). 따라서 갓분말 처리가 고지방식이군의 체중감소, 식이 효율을 감소시킨 것은 갓분말의 약리적 작용에 기인한 것으로 판단된다.

Table 2.

Effects of treatment with different concentrations of Brassica juncea L. (BJ) extract on food intake in high-fat diet-induced obese C57BL/6J mice

Group Parameters
Food intake (g/day) Water intake (g/day) Energy intake (Kcal/day) FER (%)
NFD 2.69 ± 0.11a 2.89 ± 0.43a 9.95 ± 0.41b 4.72 ± 0.91c
HFD 2.83 ± 0.11a 3.05 ± 0.66a 14.44 ± 0.57a 12.35 ± 3.13a
GC100 2.92 ± 0.22a 2.56 ± 0.63a 14.88 ± 1.14a 9.98 ± 3.12ab
BJ50 2.76 ± 0.27a 2.52 ± 0.43a 14.07 ± 1.36a 12.26 ± 2.10a
BJ100 2.76 ± 0.14a 2.96 ± 0.40a 14.09 ± 0.71a 10.65 ± 2.10ab
BJ200 2.86 ± 0.10a 3.01 ± 0.59a 14.56 ± 0.52a 9.29 ± 1.95b

Values are expressed as the mean ± SD (n = 8). Different lowercase alphabets indicate that differences between means were considered statistically significant when p < 0.05. NFD, normal diet mice group (10% fat); HFD, high-fat (60% fat) diet-induced obese mice group; BJ 50/100/200, high-fat diet-induced obese mice were orally treated with BJ extract at concentrations of 50/100/200 mg/kg/day; GC100, high-fat diet-induced obese mice were orally treated with Garcinia cambogia water extract at concentrations of 100 mg/kg/day.

장기 및 지방조직 무게

비만이 건강상 위험한 이유는 체중 자체의 증가보다는 체지방의 증가에 기인한다는 것으로 알려져 있으며(Han et al., 2009), 비만은 지방량 증가뿐만 아니라 근육량의 증가도 포함되기 때문에 체중에 비례하여 부고환 지방량을 측정함으로써 지방량의 상대적 증가를 알아보고자 하였다(Han et al., 2009). 일반적으로 고지방식이는 비만과 조직의 지방축적을 유도하고 체중을 증가시키며 간에서의 지방을 축적시켜 간조직 무게가 증가한다고 보고하였다(Lee et al., 2014; Jayasooriya et al., 2000; Han et al., 2006). 각 군의 장기 및 지방 조직 무게는 Table 3와 같다. 각 군의 신장 무게와 비장 무게는 유의한 차이가 없었으며(p > 0.05), 간 무게에서 고지방식이로 인해 HFD군이 NFD 군에 비해 1.69배 증가한 반면, 추출물 BJ100 및 BJ200 투여군은 HFD군에 비하여 간 무게가 유의적으로 감소하였다(p < 0.05). 부고환지방과 내장지방의 경우, HFD군이 NFD군에 비해 각각 3.95배와 5.04배 증가한 반면, BJ의 투여에 의해 부고환지방 및 내장지방 무게가 농도 의존적으로 감소하였으며, 특히, BJ200 군에서 감소 효과가 두드러지게 나타났다.

Table 3.

Effects of treatment with different concentrations of Brassica juncea L. (BJ) extract on tissue weight in high-fat diet-induced obese C57BL/6J mice

Group Organ wet weight (g)
Liver Kidney Spleen Epididymal fat Visceral fat
NFD 0.95 ± 0.12d 0.27 ± 0.02a 0.06 ± 0.01a 0.69 ± 0.17d 0.25 ± 0.08d
HFD 1.61 ± 0.26a 0.30 ± 0.02a 0.07 ± 0.01a 2.48 ± 0.24a 1.26 ± 0.31a
GC100 1.17 ± 0.07cd 0.29 ± 0.01a 0.06 ± 0.01a 2.21 ± 0.17b 0.88 ± 0.19c
BJ50 1.49 ± 0.20ab 0.29 ± 0.02a 0.06 ± 0.01a 2.40 ± 0.25a 1.18 ± 0.12ab
BJ100 1.25 ± 0.14bc 0.29 ± 0.01a 0.06 ± 0.01a 2.27 ± 0.17b 1.00 ± 0.27bc
BJ200 1.08 ± 0.12cd 0.29 ± 0.02a 0.06 ± 0.01a 2.15 ± 0.17c 0.79 ± 0.25c

Values are expressed as mean ± SD (n = 8). Different lowercase alphabets indicate that differences between means were considered statistically significant when p < 0.05. NFD, normal diet mice group (10% fat); HFD, high-fat (60% fat) diet-induced obese mice group; BJ 50/100/200, high-fat diet-induced obese mice were orally treated with BJ extract at concentrations of 50/100/200 mg/kg/day; GC100, high-fat diet-induced obese mice were orally treated with Garcinia cambogia water extract at concentrations of 100 mg/kg/day.

비만모델 동물의 혈장 중 지질생화학적 분석

비만에서 지방 및 당 대사 이상으로 인한 이상지질혈증은 흔히 동반되는 현상으로 식이성 비만 유도 마우스는 혈중 TG와 TC 농도가 증가하고, HDL-콜레스테롤 농도는 감소한다고 보고되었다(Lee et al., 2006). LDL-콜레스테롤은 간에서 말초조직으로 콜레스테롤을 운반하며, HDL-콜레스테롤은 말초의 콜레스테롤을 간으로 이동시켜 담즙산으로 배출시킴으로써 서로 상반된 기능으로 심혈관계 질환을 조절한다(Back et al., 2002). Table 4는 고지방식이를 급여한 마우스에서 갓 추출물의 보충이 혈액 지질지표들에 미치는 영향을 측정하였다. HFD군과 NFD군을 비교했을 때 고지방식이로 인하여 GLU, TG, TC, HDL-C, LDL-C가 유의적으로 상승한(p < 0.05) 반면, HFD군에 비해 BJ100 및 BJ200 투여군의 GLU, TG, TC, LDL-C가 유의적으로 감소하였으며(p < 0.05), 특히 BJ200 투여군에서 지질함량(TG)이 크게 감소하였다. 모든 추출물 투여군의 HDL-C 함량은 유의적인 차이를 나타내지 않았으며(p > 0.05), ALT와 AST는 모든 실험군에서 유의적인 차이가 없어 추출물로 인한 간 독성은 없는 것으로 판단된다(p > 0.05). 고지방식이 섭취는 간에서 지방산을 흡수하여 간염증 손상을 일으킨다. 비만으로 유도된 간염증은 간섬유화, 간경변증 및 간암으로 진행될 수 있다(Czaja, 2014). ALT와 AST는 간손상의 혈중 효소 바이오마커로 널리 사용되며, 체중증가 시 두 효소의 농도도 함께 증가하는 것으로 보고되었다(Stranges et al., 2004).

Table 4.

Effects of treatment with different concentrations of Brassica juncea L. (BJ) extract on serum biochemical parameters in high-fat diet-induced obese C57BL/6J mice

Group Parameters
ALT
(U/L)
AST
(U/L)
GLU
(mg/dL)
TG
(mg/dL)
TC
(mg/dL)
HDL-C
(mg/dL)
LDL-C
(mg/dL)
NFD 31.00 ± 5.53b 92.63 ± 9.29a 114.75 ± 10.65d 61.38 ± 8.33e 107.00 ± 8.88c 82.13 ± 9.05b 15.58 ± 4.98d
HFD 49.13 ± 6.83a 100.22 ± 10.28a 233.88 ± 18.43a 106.00 ± 9.20a 176.00 ± 14.24a 122.25 ± 11.78a 40.43 ± 6.53a
GC100 47.75 ± 8.07a 95.13 ± 6.66a 190.50 ± 16.02c 78.13 ± 9.85cd 158.78 ± 9.20b 126.14 ± 14.32a 24.38 ± 3.50c
BJ50 46.88 ± 8.77a 93.50 ± 8.23a 219.00 ± 17.80ab 94.88 ± 11.54b 171.25 ± 11.66a 129.38 ± 12.92a 36.38 ± 4.07a
BJ100 48.38 ± 8.16a 92.25 ± 8.92a 200.13 ± 16.95bc 84.38 ± 9.75c 159.38 ± 13.65b 131.38 ± 12.20a 30.88 ± 5.41b
BJ200 45.75 ± 8.51a 93.75 ± 9.41a 181.25 ± 15.75c 71.50 ± 10.18d 145.38 ± 11.41c 119.00 ± 10.62a 25.88 ± 3.60c

Values are expressed as mean ± SD (n = 8). Different lowercase alphabets indicate that differences between means were considered statistically significant when p < 0.05. Aspartate aminotransferase (AST); alanine aminotransferase (ALT); total cholesterol (TC); glucose (GLU); high-density lipoprotein (HDL-C); low-density lipoprotein (LDL-C); triglyceride (TG). NFD, normal diet mice group (10% fat); HFD, high-fat (60% fat) diet-induced obese mice group; BJ 50/100/200, high-fat diet-induced obese mice were orally treated with BJ extract at concentrations of 50/100/200 mg/kg/day; GC100, high-fat diet-induced obese mice were orally treated with Garcinia cambogia water extract at concentrations of 100 mg/kg/day.

지방 세포 크기 변화

체내의 지방으로 가장 많은 부위를 차지하는 부고환의 지방을 떼어내어 관찰하였다. 조직학적 소견으로 30%이상 지방축적을 보이는 부고환 지방조직에서는 다수의 지방방울(fatdroplets)과 지방 조직의 축적이 눈에 띄게 나타났다. 고지방 식이로 인하여 부고환 지방조직의 지질 축적으로 HFD군의 지방 세포 크기는 NFD군에 비하여 크게 증대한 반면, BJ100 및 BJ200 투여군의 지방 세포 크기는 HFD군에 비해 감소하였으며, 특히 BJ200 투여군의 감소가 두드러지게 관찰되었다(Fig. 2). 에너지 섭취가 triglycerides(TG)의 형태로 white adipose tissue(WAT)에 저장되며 비만이 발생하게 되는데(Lowell and Spiegelman, 2000), WAT와 구별되는 brown adipose tissue(BAT)는 다분자 지방구와 non-shivering thermogenesis라는 과정을 통해 체온을 유지하기 위해 열을 발생시키는 다수의 미토콘드리아로 구성된다(Cannon and Nedergaard, 2004). BAT는 비만과 관련된 질병으로부터 잠재적으로 보호하여 비만 예방효과를 나타낸다(Kajimura et al., 2015). 이와 같이 갓에 함유되어있는 플라보노이드성분 중 sinigrin이 WAT 생성을 억제하고 TG의 축적을 억제시키는 것으로 판단되어 추후 sinigrin 분획을 통한 비만연구의 진행이 필요한 것으로 판단된다.

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Fig. 2.

Effects of treatment with different concentrations of Brassica juncea L. (BJ) extract on adipocyte size in epididymal adipose tissue.

Adipogenesis 및 Lipogenesis 전사인자 발현 조사

PPAR는 peroxisome proliferator를 ligand로 하는 핵 호르몬 수용체(nucler hormone receptor)로 에너지와 지방 대사를 조절하는 주요 전사인자이다. PPARα는 주로 지방의 이화작용(catabolism)을 촉진하고, PPARγ는 지방조직에서 주로 발현되어 지방세포의 분화(adipogenesis)를 촉진하여 크기가 큰 지방세포의 수를 줄이는 역할을 한다. HFD군과 비교하였을 때, BJ200 투여군에서만 PPARγ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma)의 발현이 유의적으로 감소하였다(p < 0.05). C/EBP(CCAAT/enhancer binding protein)는 백색지방조직과 갈색지방조직에서 발현되는 지방세포분화 전사인자로 C/EBPβ와 C/EBPδ는 지방세포 분화과정의 초기단계에 발현이 증가되어 PPARγ의 발현을 유도하며 PPARγ의 발현증가는 C/EBPα의 지방세포 분화후기의 발현을 유도하며 지방세포 증식과 인슐린 민감도 항진에 관여한다. C/EBPα(CCAAT/enhancer binding protein alpha)는 BJ100 및 BJ200 투여군에서 유의적인 감소를 보였으나(p < 0.05), BJ100과 BJ200 투여군간은 서로 유의적인 차이가 없었으며(p > 0.05), SREBP-1c (sterol regulatory elementbinding factor 1)의 발현은 BJ100 및 BJ200 투여군에서 유의적으로 감소하였다(p < 0.05). 그러나, 앞선 C/EBPα와 마찬가지로 BJ100과 BJ200 투여군은 서로 유의적인 차이가 없게 나타났다(p > 0.05). 본 실험에서 갓분말 추출물은 transcription factor인 PPARγ, C/EBPα 및 SREBP-1c의 발현을 유의적으로 감소시켜 지방합성 억제 효과가 있는 것으로 나타냈으나, 100-200 mg/kg/day의 투여 농도에서는 농도 의존성은 나타나지 않았다(Fig. 3).

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Fig. 3.

Effects of treatment with different concentrations of Brassica juncea L. (BJ) extract on protein expression of adipogenesis and lipogenesis transcription factors in epididymal fat. Values are expressed as mean ± standard deviation (SD; n = 3). Different lowercase alphabets indicate that differences between means were considered statistically significant when p < 0.05. Normal diet (NFD; 10% fat)-fed mouse group; high-fat diet-induced obese mouse groups: HFD (60% fat) BJ 50/100/200, where HFD-induced obese mice were orally treated with BJ extract at 50/100/200 mg/kg/day. GC100 HFD-induced obese mice were orally treated with Garcinia cambogia water extract at 100 mg/kg/day.

AMPK 신호 경로의 활성화

AMPK(AMP-stimulated protein kinase)는 유리지방산의 지질대사에 관여하는 것으로 알려져있으며, 비만인 사람의 경우 지방세포 내 축적된 지방으로 부터의 유리지방산은 산화스트레스를 증가시키게 되며 인슐린저항성이 있을 경우 염증반응의 활성화를 유도하게 된다. β-oxidation은 유리지방산을 이용하므로 축적된 지방의 감소 및 에너지 생성에 기여하여 비만에서 대사증후군으로의 발달을 억제할 수 있을 것으로 사료된다. 갓 추출물을 투여한 군에서 고지방 식이로 감소된 adiponectin의 발현이 농도 의존적으로 현저히 증가하였으며(p < 0.05), 갓 추출물을 투여한 군의 phospho-AMP-dependent kinase(p-AMPK)도 adiponectin과 유사하게 HFD군에 비하여 현저히 증가하였다(Fig. 4). 본 실험 결과, 갓 추출물의 투여는 adiponectin을 증가시켜 adiponectin receptor를 통해 AMPK의 인산화로 AMPK pathway를 활성화시켜 생체네 에너지 대사를 개선하는 것으로 판단된다. 즉, 에너지 소모과정인 지방합성과정을 감소시키는 반면 에너지 생성과정인 지방산의 β-oxidation을 촉진시키는 것으로 사료된다.

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Fig. 4.

Effects of treatment with different concentrations of Brassica juncea L. (BJ) extract on protein expression of adiponectin and phospho (p)-AMPK in epididymal fat. Values are expressed as mean ± standard deviation (SD; n = 3). Different lowercase alphabets indicate that differences between means were considered statistically significant when p < 0.05. Normal diet-fed mouse group: NFD (10% fat); high-fat diet-induced obese mouse groups: HFD (60% fat) BJ 50/100/200 wherein HFD-induced obese mice were orally treated with BJ extract at 50/100/200 mg/kg/day. GC100 high-fat diet-induced obese mice were orally treated with Garcinia cambogia water extract 100 mg/kg/day.

Acknowledgements

본 성과물은 중소벤처기업부에서 지원하는 2020년도 창업성장기술개발 디딤돌 창업과제 첫걸음 사업(No. S2958838)의 연구 수행으로 인한 결과물임을 밝힙니다.

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