Research Article

Journal of Agricultural, Life and Environmental Sciences. 31 December 2021. 277-281
https://doi.org/10.22698/jales.20210027

ABSTRACT


MAIN

  • 서 론

  • 재료 및 방법

  •   검정용 바이러스 클론

  •   바이러스 특이 프라이머 제작

  •   PCR 및 Gradient PCR 조건

  • 결과 및 고찰

서 론

우리나라의 경우 지구 온난화에 의한 기후변화로 인해 1910년 이후 기온(1.8°C)이 상승하고 강수량(19%)이 증가하였으며, 대부분 지역이 온대 기후에서 아열대 기후로 바뀔 것으로 전망된다. 통계청에 의하면 주요 과수 작물의 주산지가 남부지방에서 영동지역으로 북상하는 것으로 나타났으며, 사과, 복숭아, 포도 등의 재배 가능지는 점점 감소되고, 아열대 기후에 적합한 감귤, 단감 등의 재배 가능지는 점차 확대될 것으로 예측하고 있다. 이에 대응하여 신소득 작목으로 아열대 작물이 주목받고 있다. 국내 아열대 과수의 재배면적은 2017년 109.4 ha에서 2019 년 170.0 ha로 꾸준히 증가하고 있으며, 자유무역협정(Free Trade Agreement, FTA) 이후 과일 수입이 연평균 10% 이상 증가하였고, 수입 과일 품목과 국가도 다양해지고 있다(Kang et al., 2018; Kim et al., 2019).

아열대 작물 중 하나인 바나나(Musa spp.)는 파초과에 속하며, 미네랄과 비타민 등 영양이 풍부하여 전 세계적으로 인기 있는 작물 중 하나이다. 전체 생산량은 1.55억만 톤이 넘으며, 연간 소득은 약 9.2조로 추정된다. 국내에서도 아열대 과수 중 가장 많이 생산되고 있는데 대부분이 제주도에서 재배되고 있다. 또한, 국내 수입 과일 중 비중이 가장 높으며 지속적으로 수입량이 증가하고 있는 추세이다. 하지만 바나나 바구미와 선충 같은 해충과 FusariumXanthomonas에 의한 시들음병, Banana bunchy top virus와 Banana streak virus(BSV) 등 병원균에 의해 수확량이 감소하고 있다(Jekayinoluwa et al., 2020; Kim et al., 2020; Mengstu et al., 2021).

Banana mild mosaic virus(BanMMV)는 Betaflexiviridae에 속하는 양성 단일 가닥 RNA 바이러스로 속(Genus)은 아직 지정되지 않았다. BanMMV는 남아메리카, 아시아, 아프리카, 오세아니아, 호주 등 전 세계 바나나 재배지 대부분에 퍼져 있다(Hanafi et al., 2020). BanMMV가 단독감염의 경우 잎에서 약한 황화 현상을 보이나, 복합감염 시 시너지를 일으켜 더욱 심각한 병징을 나타낸다. Cucumber mosaic virus(CMV)와 복합감염 시 잎에서 괴사가 일으키며, 우간다에서는 badnavirusfilamentous virus(BanMMV와 매우 유사함) 심각한 왜소와 기형 증상을 보이며, 특히, 바이러스의 복합감염은 식물에서 곰팡이병에 더욱 취약하게 만들 수 있다(Geering, 2007; Teycheney et al., 2007).

한반도 기온상승으로 인해 국내 아열대 작물의 재배량이 증가하고 있으며, 국가 간 교류가 활발해짐에 따라 해외 바이러스의 국내 유입 가능성이 높아지고 있으며, 이에따라, 병원체 유입을 사전에 방지하기 위한 검출법 개발이 필요하다. 본 연구에서는 바나나에 감염하는 BanMMV를 검출할 수 있는 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR) 기법을 이용하여 바이러스를 신속진단할 수 있는 BanMMV 특이 프라이머를 개발하고자 하였다.

재료 및 방법

검정용 바이러스 클론

검출법 개발에 사용될 BanMMV의 경우 현재 국내 유입되지 않은 바이러스이기 때문에 유전자 합성을 이용해 바이러스 클론을 제작하였다. 미국 국립생물공학정보센터(National Center for Biotechnology Information, NCBI) GeneBank에 등록되어 있는 BanMMV의 핵산 중 다른 isolate와 유사도가 높은 EF143976의 외피 단백질(Coat protein)의 유전자를 pUC57 vector에 삽입한 클론을 바이오닉스(BIONICS, Korea)에서 제작하여 실험에 사용하였다.

바이러스 특이 프라이머 제작

바이러스 특이적인 PCR 프라이머 제작을 위해 NCBI GenBank에서 등록된 BanMMV(NC_002729, KU378053, KT780866, AY366188, AY366187, AY366186, AY319333, AY319332, AY319331, EF188275, EF143979, EF143978, EF143977, EF143976)의 CP 유전자 염기서열을 참조하였다. PCR 프라이머 디자인 도구인 Primer3 (Whitehead Institute/MIT Center for Genome Research, USA) 프로그램을 이용하여 정방향 3개와 역방향 3개의 프라이머를 설계하였다(Table 1).

Table 1.

Primer sequences designed for PCR detection of BanMMV

Primer name Primer sequence (5’→3’) Target gene Length (bp)
BanMMV CP 88F RARTAYGAYRGYTCHARY Coat protein 18
BanMMV CP 119F CHACWHTDGARCRRATGGC Coat protein 19
BanMMV CP 344F CHYTVGTDGCHGCVRTWAGRG Coat protein 21
BanMMV CP 468R RAAMCCWYKTTTYTGCCARTG Coat protein 21
BanMMV CP 563R GTWGGYARYCTHGAWATYCCDG Coat protein 22
BanMMV CP 701R AGRCTCATRAYYTCYGG Coat protein 17

PCR 및 Gradient PCR 조건

바이러스를 진단하기 위한 PCR 반응 혼합물은 바이러스 클론 1 µl, 프라이머 각 1 µl(10 pmol), EzPCR Basic 5x Master Mix(ELPIS-BIOTECH, Korea) 4 µl, 멸균수 13 µl를 첨가하여 총 20 µl로 하였다. PCR 조건은 95°C에서 3분간 처리 후, 95°C에서 30초, 55°C에서 30초, 72°C에서 30초의 조건으로 35 cycle을 수행한 뒤 72°C에서 5분간 처리하였다. 프라이머의 최적 온도를 탐색하기 위한 Gradient PCR 조건은 5°C에서 3분간 처리 후, 95°C에서 30초, 50-60°C에서 30초, 72°C에서 30초의 조건으로 35 cycle을 수행한 뒤 72°C에서 5분간 처리하였다.

결과 및 고찰

바나나에서 발생하는 Banana mild mosaic 병을 진단할 수 있는 특이 프라이머 조합 개발을 위하여 1차적으로 프라이머를 선발하였다(Table 2). PCR 실험 결과, 총 9개의 프라이머 조합 중 4, 5, 6번 조합이 BanMMV에 대하여 특이적으로 반응하였고, 각각의 PCR 산물 역시 4번 조합에서 350 bp, 5번 조합에서 445 bp, 6번 조합에서 583 bp 크기로 예상했던 PCR 산물과 일치하였다(Fig. 1).

Table 2.

Primer sets used for BanMMV detection

No. Primer set PCR product (bp)
1 BanMMV CP 88F + BanMMV CP 468R 381
2 BanMMV CP 88F + BanMMV CP 563R 476
3 BanMMV CP 88F + BanMMV CP 701R 614
4 BanMMV CP 119F + BanMMV CP 468R 350
5 BanMMV CP 119F + BanMMV CP 563R 445
6 BanMMV CP 119F + BanMMV CP 701R 583
7 BanMMV CP 344F + BanMMV CP 468R 125
8 BanMMV CP 344F + BanMMV CP 563R 220
9 BanMMV CP 344F + BanMMV CP 701R 358

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Fig. 1.

Detection of Banana mild mosaic virus (BanMMV) using the BanMMV-specific primer sets (Table 2) via PCR amplification with (A) the BanMMV CP clone as PCR template and (B) DW as PCR template (negative control). (M) Size marker (100 bp DNA ladder). Lane 1, PCR amplification using BanMMV CP 88F + BanMMV CP 468R; lane 2, BanMMV CP 88F + BanMMV CP 563R; lane 3, BanMMV CP 88F + BanMMV CP 701R; lane 4, BanMMV CP 119F + BanMMV CP 468R; lane 5, BanMMV CP 119F + BanMMV CP 563R; lane 6, BanMMV CP 119F + BanMMV CP 701R; lane 7, BanMMV CP 344F + BanMMV CP 468R; lane 8, BanMMV CP 344F + BanMMV CP 563R; lane 9, BanMMV CP 344F + BanMMV CP 701R.

BanMMV의 기주식물인 바나나 식물 유전자와 기주 유사관계 바이러스에 대해서 선발된 3종 프라이머 조합과의 반응 여부를 확인하기 위해, 건전한 바나나 잎에서 RNA를 추출한 뒤 random hexamer로 합성한 complementary DNA(cDNA)와 CMV에 감염된 바나나 잎에서 RNA를 추출하여 합성한 cDNA를 template로 하여 선발된 3종 프라이머 조합을 이용해 PCR을 실시하였다. 그 결과 3종의 프라이머 조합에서 기주식물과 기주 유사관계 바이러스에 대해 비특이적인 반응 없이 깔끔한 결과를 보여주었다(Fig. 2).

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Fig. 2.

Non-specificity test of the selected BanMMV-specific primer sets using total RNA extracted from banana plant as a template. PCR amplification using BanMMV CP 119F plus (A) BanMMC CP 468R; (B) BanMMC CP 563R; and (C) BanMMC CP 701R. (M) Size marker (100 bp DNA ladder). Lane 1, healthy banana; lane 2, Cucumber mosaic virus-infected banana leaf; lane 3, DW (negative control); lane 4, BanMMV CP clone (positive control).

또한, 선발된 3종 프라이머 조합의 PCR 조건을 최적화하기 위하여 Gradient PCR을 수행한 결과, 3종의 프라이머 조합에서 모두 annealing 온도가 50.0-56.0°C 사이에서는 끌림 없이 선명한 밴드를 보였다(Fig. 3).

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Fig. 3.

Test to optimize the PCR reaction using the selected BanMMV-specific primer sets via gradient PCR. Gradient PCR amplification using BanMMV CP 119F plus (A) BanMMC CP 468R; (B) BanMMC CP 563R; and (C) BanMMC CP 701R. (M) Size marker (100 bp DNA ladder). Lanes 1 to 8: 50.0, 50.7, 51.9, 53.8, 56.1, 58.0, 59.2, and 60.0°C, respectively.

기후변화로 인해 국내 재배 작물의 변화가 발생하여 아열대 작물의 재배지가 확대되고 있으며, 국가 간 농산물 교역이 증가함에 따라 외부 식물 바이러스 유입 가능성이 높아지고 있다. 하지만 수출입 식물에 대한 바이러스 정밀검사 과정에서 비특이반응 등의 문제가 발생하여 검역 현장의 애로사항으로 도출되고 있으며, 아열대 바이러스에 대한 검사법이 충분히 개발되어 있지 않다. 식물검역을 위한 바이러스 검역 검사는 주로 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)와 PCR이 이용되며, 검사법의 이용성, 적용성, 관리 효율성 등의 이점에 따라 PCR에 대한 의존도가 급격히 높아지고 있다. 선발된 3종의 BanMMV를 검출하기 위한 프라이머 조합을 이용한 PCR 검출법은 1 ng의 양으로도 검출이 가능할 정도로 높은 민감도를 보이고 있으며, BanMMV를 특이적으로 검출하여 신속하게 진단할 수 있다.

Acknowledgements

본 결과물은 농림축산식품부의 재원으로 농림식품기술기획평가원의 작물바이러스 및 병해충대응 산업화기술개발사업의 지원을 받아 연구되었음(과제번호. 320044-3).

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