서 론
재료 및 방법
실험재료 및 시약
추출물 제조
피부 섬유아세포 배양
XTT assay를 이용한 세포독성 평가
산화적 스트레스에 의한 세포 손상 보호효과 측정
H2-DCFDA assays를 이용한 산화적 스트레스 측정
SA-β-galactosidase assay를 이용한 세포노화 측정
통계분석
결과 및 고찰
진달래 추출물의 세포독성 평가
Hydrogen peroxide로 유도된 세포손상에 대한 세포 보호효과
H2-DCFDA 염색을 통한 세포내 항산화 효과
SA-β-galactosidase 염색을 통한 세포노화 억제 효과
요 약
서 론
피부의 노화는 시간의 흐름에 따라 발생하는 자연적인 노화 현상인 내인성노화(intrinsic aging)와 바람, 온도, 습도, 환경호르몬, 자외선 등 환경에 노출되어 생기는 외인성 노화로 나눌 수 있다(Claude et al., 1993). 특히, 많은 양의 자외선에 노출이 되어 발생하는 광노화는 높은 농도의 ROS의 생성이 원인이 된다. 피부는 ROS에 대한 체내 방어 체계가 발달되어 있지만 계속된 활성산소 영향은 피부의 효소적, 비효소적 항산화 방어체계를 붕괴시킨다(Jurkiewicz et al., 1994; Jurkiewicz et al., 1995). 결과적으로 증가된 활성산소는 지질 과산화 반응을 개시하며, 단백질 및 DNA의 산화뿐만 아니라 콜라겐과 엘라스틴의 사슬절단 및 비정상적인 교차결합을 유발시킨다. 콜라겐은 피부 진피층에서 matrix를 이루는 주성분으로 피부의 강도와 장력을 부여하여 외부의 자극으로부터 피부를 보호하는 역할을 한다(Pak et al., 2016). 따라서 콜라겐의 분해는 피부의 노화와 밀접한 관련이 있어 탄력 저하, 색소 침착, 주름생성 등의 피부질환의 원인이 된다(Droge, 2002; Harman, 2014; Kim et al., 2014). 이러한 활성산소에 의한 질병을 억제하기위해 기능성 식품, 의약품 및 화장품 산업에서는 BHT (butylated hydroxytoluene), BHA (butylated hydroxtanisol)등의 합성항산화제를 사용되고 있지만 많은 연구에서 이들의 장기 식용에 따른 부작용으로 암 및 세포내 독성을 보고하고 있다(Safer and Al-Nughamish, 1999). 따라서 합성 항산화제를 효과적으로 대체할 항산화제를 민간요법이나 한방에서 효능이 입증된 천연물을 중심으로 활발하게 이루어지고 있다.
전통지식(traditional knowledge)은 생물자원과 더불어 생활해온 사람들에 의해 형성되고 구정 및 기록되어온 실천적, 토착적 지식을 말한다. 나고야 의정서 채택이후 국내 유전자원의 보호를 위해 이러한 전통지식을 확보하고 보호하려는 가운데 국내 산림자원 중 식품원재료 database에 등재된 원료에 대한 효능을 평가하는 것은 매우 시의적절한 연구로 사료된다(Choi et al., 2017). 현재까지 국내 산림직역에서 자생하는 식물의 열매를 제외한 잔가지, 줄기 및 잎을 이용하여 항산화 및 항노화에 관한 연구가 많지 않고, 이를 이용하여 식품가공 원료로 적용한 연구도 초기단계에 불과하다.
특히 본 연구에서 사용된 진달래는 꽃의 성분으로 플라보노이드 성분인 quercetin, myricetin, afzelin, catechin 등이 분석되었으며, 그 효능으로 항산화, 항암, 항균, 심장질환 및 당뇨병 예방 등이 보고(Kim et al., 1996)되었지만, 잎 및 가지의 효능 평가는 전무한 실정이다. 본 연구팀의 전보(Cho et al., 2015)에서는 국립생물자원관으로부터 진달래 잎 및 잔가지를 제공받아 항산화 활성 및 성분을 분석하였으며, 본 논문에서는 피부 섬유아세포에서 항산화 및 항노화 효능을 평가하였다.
재료 및 방법
실험재료 및 시약
본 연구에서 사용된 진달래 잎 및 잔가지는 2014년에 충청남도 청양군 칠갑산에서 채집한 것으로 국립생물자원관으로부터 제공받았다. 피부 섬유아세포(human dermal fibroblast, HDF) 배양에 사용된 시약으로는 fetal bovine serum (FBS), Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM), phosphate-buffered saline (PBS) 및 trypsin-EDTA 등은 Gibco (Gaithersburg, MD, USA)로부터 구입하여 사용하였으며, 2´, 7´-dichlorofluorescin diacetate (H2-DCFDA), β-D-galactopyranoside (X-Gal) 및 ascorbic acid는 sigma (St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였다.
추출물 제조
진달래 잎 및 잔가지의 추출은 수용성 화합물과 지용성 화합물을 함께 추출하기 위하여 70% 에탄올을 사용하였으며, 시료 136.5 g을 에탄올 1,000 mL에 24시간 동안 침지하여 추출하였다. 상기 추출 과정을 3회 반복하고, 얻어진 추출액은 모두 합하여 filter paper (Whatman, No. 3, Maidstone, Kent, UK)로 여과하였다. 여과된 추출액을 진공회전농축기(EYELA, N-3000, Tokyo, Japan)를 사용하여 감압농축한 후, 동결건조(Ilshinbiobase Co., Ltd, Yangju, Korea)하여 분말화 하였다. 동결건조 후 얻어진 추출물은 7.16 g으로 5.24%의 수율을 수득하였다.
피부 섬유아세포 배양
피부 섬유아세포(human dermal fibroblast)는 American Type Culture Collection (ATCC, PCS-201-012, Manassas, VA, USA)으로부터 분양 받아 사용하였다. 피부 섬유아세포는 실험목적에 따라 6-well 및 96-well plate에 각각 1 × 106 cells/well을 seeding한 후, FBS (10%) 및 P/S (1%)를 함유한 저농도 포도당 DMEM (89%)에서 24시간 배양하였다. 이 때, 진달래 추출물의 효과를 관찰하기 각각 25, 50 및 100 µg/mL로 처리하였고, 양성 대조군에는 항산제인 ascorbic acid 50 µM을 처리하여 비교하였다.
XTT assay를 이용한 세포독성 평가
피부 섬유아세포에 대한 진달래 추출물의 세포독성 평가는 XTT {2,3-bis (2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H- tetrazolium-5-carboxanilide innersalt} assay kit를 이용하여 측정하였다. 피부 섬유아세포를 96-well plate에 1 × 106 cells/well을 분주하여 24시간동안 배양하고, 진달래 추출물을 각각 25, 50 및 100 µg/mL의 농도로 처리하여 24시간 동안 배양하였다. XTT 및 PMS (N-methylphenazonium methyl sulfate) reagent를 이용하여 XTT working solution을 만들고, 각 well 40 µL 씩 분주하여 CO2 incubator (MCO-20, SANYO, Osaka, Japan)에서 4시간 동안 배양하여 반응을 유도한 후, microplate reader (Spectramax i3, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 450 nm 흡광도 값에서 690 nm의 흡광도값을 뺀 결과 값으로 세포 독성을 측정하였다.
산화적 스트레스에 의한 세포 손상 보호효과 측정
산화적 스트레스에 의한 세포 손상 보호효과는 XTT assay를 이용하여 측정하였다. XTT assay와 마찬가지로 같은 양의 피부 섬유아세포를 24시간 동안 배양하여 부착시킨 뒤, 진달래 추출물을 각각 25, 50 및 100 µg/mL의 농도로 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 그 다음 산화적 스트레스를 유발하기 위하여 1 mM hydrogen peroxide를 1.5시간 동안 처리하였다. 이 후, 배지를 제거하고 각 well에 XTT working solution이 함유된 배지를 분주하여 CO2 incubator에서 4시간 동안 배양하여 반응을 유도한 후, microplate reader (Spectramax i3, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 450 nm 흡광도 값에서 690 nm의 흡광도값을 뺀 결과 값으로 세포 독성을 측정하였다.
H2-DCFDA assays를 이용한 산화적 스트레스 측정
산화적 스트레스에 의한 세포내 활성산소를 측정하기 위해 H2-DCFDA assay를 이용하였다. 피부 섬유아세포를 cover glass가 들어있는 6-well plate에 1 × 106 cells/well을 분주하고 24시간 동안 배양하여 부착시킨 뒤, 진달래 추출물을 각각 25, 50 및 100 µg/mL의 농도로 처리하고 24시간 동안 배양하였다. 그 다음 산화적 스트레스를 유발하기 위하여 1 mM hydrogen peroxide를 1.5시간 동안 처리하고 멸균된 PBS (pH 7.4)를 이용하여 2회 세척하였다. 또한 세포고정을 위해 4% paraformaldehyde 용액 1 mL를 첨가하여 15분간 실온에서 방치한 뒤 제거하였다. 빛 이 들어가지 않도록 주의 하여 10 µM H2-DCFDA를 처리하고 37°C에서 2시간 동안 반응 시킨 뒤 Gel/Mount를 이용하여 마운팅하고 역상현미경(Leica DM 300B, Wetzlar, Germany)로 관찰하였다. 또한 fluorescent microplate reader (Spectramax i3, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 사용하여 DCF (Ex=485 nm; Em=525 nm)에 의한 세포내 형광값을 측정하였다.
SA-β-galactosidase assay를 이용한 세포노화 측정
활성산소에 의한 피부 섬유아세포의 노화를 측정하기 위해 β-galactosidase assay를 이용하였다. 피부 섬유아세포를 6-well plate에 1 × 106 cells/well을 분주하여 24시간동안 배양하고, 진달래 추출물을 각각 25, 50 및 100 µg/mL의 농도로 처리하고 24시간 동안 배양하였다. 그 다음 산화적 스트레스를 유발하기 위하여 1 mM hydrogen peroxide를 1.5시간 동안 처리하고 새로운 배지로 5일간 배양하였다. 또한 세포고정을 위해 4% paraformaldehyde 용액 1 mL를 첨가하여 15분간 실온에서 방치한 뒤, X-gal solution (5 mM potassium ferricyanide, 5 mM potassium ferrocyanide, 2 mM magnesium chloride, 1 mg/mL 5-bromo-4chloro-3-indolyl β-D-galactoside)을 처리하고 37°C에서 24시간 동안 배양하여 염색하였다. 염색된 세포는 광학현미경(Olympus, Tokyo, Japan)을 통하여 염색된 세포 수를 측정하였다.
통계분석
모든 실험결과는 SAS (9.4, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)를 이용하여 통계분석하였다. 유의성 분석은 ANOVA 검정을 실시하였으며 Duncan의 다중범위 검정법(Duncan’s multiple rage test)으로 유의성은 p < 0.05 수준에서 검정하였다.
결과 및 고찰
진달래 추출물의 세포독성 평가
진달래 추출물의 피부 섬유아세포에 대한 세포 독성을 알아보기 위하여 XTT assay를 실시하였다. XTT assay는 XTT에 election coupling agent 역할을 하는 PMS (phenazine methosulfate)를 첨가하여 bioredution을 증가시킨 후, 대사가 활발한 살아있는 세포의 XTT solution을 첨가하여 mitochondrial dehydrogenase 효소에 의해 XTT가 분열이 되면, 무색 또는 노란색에서 짙은 붉은색의 formazan을 생성하는 원리를 이용한 방법이다(Kim et al., 2011). 피부 섬유아세포에 대한 진달래 추출물의 세포독성은 Fig.1과 같다. 진달래 에탄올 추출물은 100 µg/mL 농도까지 세포 생장에 영향을 미치지 않은 것으로 나타났으며, 현미경 상에서 morphology의 변화도 관찰되지 않았다. 따라서 진달래 추출물의 25－100 µg/mL의 농도를 이용하여 세포 보호 효과, 항산화 및 항노화 활성을 측정하였다.
Hydrogen peroxide로 유도된 세포손상에 대한 세포 보호효과
Hydrogen peroxide로 유도한 산화적 스트레스 상태에서 진달래 추출물이 피부 섬유아세포의 cell viability에 미치는 영향을 XTT assay로 측정하였고, 그 결과는 Fig. 2와 같다. 피부 섬유아세포에 1 mM hydrogen peroxide로 세포 손상을 유도한 음성 대조군에서는 control에 비해 80% 정도로 세포 생존율이 감소하였으며, 현미경 상에서의 cell morphology가 손상된 것으로 확인된 반면, 양성 대조군으로 50 µM ascorbic acid를 처리한 세포들은 hydrogen peroxide에 의한 산화적 손상이 억제되는 것으로 관찰되었다. 또한 100 µg/mL 진달래 추출물에서는 control과 비슷한 정도로 세포 생존율이 다시 증가하는 경향을 보였다. 본 연구팀의 전보(Cho et al., 2015)에서는 진달래 추출물의 우수한 항산화 활성과 높은 폴리페놀 함량을 보고하였고, 이는 Jeong et al. (2010)의 연구에서 다양한 페놀성 화합물이 활성산소로 인한 산화적 스트레스로부터 세포를 보호한다는 것과 유사한 결과로 사료된다.
Fig. 2.
Cell viability on H2O2-induced cell damage in human dermal fibroblasts (HDFs) cell system. HDFs were treated with 1 mM H2O2 and stained with XTT to show survival cells compared to non-treated group. All values are presented as means ±SD. Bars with different letters indicate statistically significant differences among groups at p<0.05 by one-way ANOVA.
H2-DCFDA 염색을 통한 세포내 항산화 효과
본 실험에서는 hydrogen peroxide로 인한 산화적 스트레스 상태에서 진달래 추출물 처리에 따른 세포내 항산화를 H2-DCFDA 염색을 통해 확인하였다(Fig. 3). DCF-DA는 세포내 esterase에 의해 효소적으로 가수분해 되어 비형광성 DCF-H가 되며, DCF-H는 hydroxyl radical, nitrogen oxide radical, thiyl radical, bicarbonate radical 등에 의해 빠르게 높은 형광을 띈 DCF로 산화를 이용한 방법이다(Lee et al., 2005). 1 mM hydrogen peroxide을 처리한 음성 대조군에서는 control에 비해 약 180%로 세포내 ROS 생성이 증가한 반면, 갈참나무 잎 추출물에서는 농도 의존적으로 세포내 ROS 생성이 감소함을 확인 하였다. 특히, 100 µg/mL의 갈참나무 잎 추출물에서는 양성 대조군인 ascorbic acid와 비슷한 수준을 보였다. 이와 같은 결과는 진달래 추출물의 다양한 항산화 활성 및 높은 폴리페놀 함량으로 판단되며, Jeong et al. (2011)의 연구에서 폴리페놀성 화합물이 세포내 ROS 생성저감에 영향을 미친다는 것과 유사한 결과로 사료된다.
Fig. 3.
Intracellular reactive oxygen species (ROS) generation in human dermal fibroblasts (HDFs) treated with RTE or H2O2. Image of the intracellular ROS levels by fluorescence microscopy (A) and the relative fold increase of detected ROS (B). Intracellular ROS generation was measured using the H2DCFDA method. Cell was exposed to RTE for 24 h, then 1 mM H2O2 for 2 h. All values are presented as means ±SD. Bars with different letters indicate statistically significant differences among groups at p<0.05 by one-way ANOVA.
SA-β-galactosidase 염색을 통한 세포노화 억제 효과
Hydrogen peroxide로 유도한 산화적 스트레스 상태에서 진달래 추출물이 피부 섬유아세포의 노화억제에 미치는 영향을 SA-β-galactosidase 염색을 통하여 측정하였고, 그 결과는 Fig. 4와 같다. SA-β-galactosidase assay는 lactose 유사체인 X-gal이 β-galatosidase에 의해서 분해되면서 생성되는 5-bromo-4-chloro-3-hydroxyindole에 의해 파란색으로 염색된 세포의 수를 비교하는 실험으로, 노화된 세포일수록 β-galactosidase의 발현이 높기 때문에 파란색으로 염색되면 노화가 많이 진행되었을 알 수 있다(Yoon et al., 2012). 1 mM hydrogen peroxide을 처리한 음성 대조군에서는 SA-β-gal 활성이 증가한 반면, 진달래 추출물 처리군에서는 농도 유의적으로 SA-β-gal 활성이 감소됨을 확인하였다. 이는 진달래 추출물의 높은 항산화 활성 및 폴리페놀성 화합물이 세포의 산화적 스트레스에 대한 저항성을 증가시키고 활성 산소를 감소시켜 세포손상을 방어하여 결과적으로 세포의 노화를 억제하는 것으로 사료된다.
Fig. 4.
The suppressible effect of RTE on H2O2-induced expression of SA-β-galactosidase in HDFs. SA-β-galactosidase expression by H2O2-treated cells in control, RTE-treated cells. The photographic images (a) and the representative percentage of X-gal positive cells (b). All values are presented as means ±SD. Bars with different letters indicate statistically significant differences among groups at p<0.05 by one-way ANOVA.
요 약
현재 식품 공전에 식품원료로 사용이 가능한 것으로 등록된 국내 산림지역 자생 식물을 식품산업에 활용하고자 국내 자생식물 45종을 선별하였고, 본 연구팀의 선행연구에서 45종의 항산화 활성을 평가한 결과, 다른 종들과 비교하여 우수한 항산화 활성을 보인 진달래를 본 연구에서 사용하였다. 피부 섬유아세포에 Hydrogen peroxide로 산화적 스트레스를 유도한 상태에서 진달래 추출물의 세포 보호효과 및 세포내 항산화 효과를 관찰하였다. 세포 보호효과를 측정한 결과 Hydrogen peroxide로 인해 세포 생존율이 감소한 반면 진달래 추출물처리로 세포의 산화적 손상이 억제되는 것으로 관찰되었다. H2-DCFDA 염색을 통해 세포내 항산화 효과를 확인한 결과 진달래 추출물에 의한 활성산소 저감을 확인하였다. 또한 SA-β-galactosidase assay를 통해 항노화 효과를 확인한 결과 진달래 추출물을 처리했을 때 세포의 SA-β-galactosidase 활이 줄어드는 것을 확인할 수 있었다. 이상의 결과를 종합하여 볼 때 진달래 추출이 Hydrogen peroxide로 산화적 스트레스를 유도한 상태에서 세포 생존율을 증가시키고 세포내 활성산소의 생성을 억제하며 이로 인해 세포 노화억제가 관찰되어 천연물에서 유래한 기능성 식품원료로서의 활용도가 매우 넓을 것으로 판단된다.
