서 론

상추(Lactuca sativa L.)는 국화과에 속하는 채소류로 쌈, 샐러드, 샌드위치 등에 이용되는 등 전 세계적으로 재배되고 있는 웰빙 채소이다(Kim et al., 2018). 상추는 우리나라에서 잎상추(청치마, 청축면, 적축면, 적치마상추), 결구상추, 로메인상추 등이 생산되고 있는데, 웰빙에 대한 관심도가 증가함에 따라 상추의 재배면적과 생산량이 20년 기준 3,629 ha, 95,582 톤으로 엽채류인 배추, 양배추 다음으로 많은 비중을 차지할 정도로 증가하고 있는 추세이다(KOSIS, 2019; Kim et al., 2021). 상추는 시설재배 생산액 중 단일품목으로 1위를 차지하고 있으며, 그 중 로메인 상추는 조직감과 향이 우수하여 소비자의 선호도가 높은 품목으로써 향후 쌈 및 샐러드 재료로써 소비가 계속 늘어날 것으로 전망된다(Bae et al., 2016; Kim et al., 2018).

국내외로 보고된 상추 가해 병원균은 Alternaria alternata에 의한 점무늬병(leaf spot), Fusarium oxysporum에 의한 시들음병(Fusarium wilt), Botrytis cinerea에 의한 잿빛곰팡이병(gray mold), Bremia lactucae에 의한 노균병(downy mildew), Phytophthora drechsleri에 의한 역병(Phytophthora root rot), Pythium ultimum에 의한 모잘록병(damping-off), Rhizoctonia solani에 의한 밑둥썩음병(bottom rot), Sclerotinia sclerotiorum에 의한 균핵병(Sclerotinia rot)등이 있다. 최근 국내에서 기존에 등록된 농약 종류에 따른 A. alternata 균사생장 억제효과에 대한 연구가 진행되었고, fludioxonil, difenoconazole, boscalid 등의 살균제가 A. alternata 방제에 효과가 있는 것으로 보고되었다(Kim et al., 2021). 살균제와 같은 화학농약의 경우 농업 생산성에 크게 기여하고 있으나, 약재 내성균 등장과 잔류독성, 수질오염 등 환경오염 문제로 화학농약의 부정적 영향이 우려되고 있다(Kim, 2000; Lee et al., 2009; Ryu et al., 2001). 최근에는 상추 소비량이 늘면서 소비자들의 농산물 안전성에 대한 관심이 증가하고 있고 친환경농업에 대한 관심과 수요 역시 증가하고 있지만, 아직 상추에 대한 병원균을 방제하기 위한 친환경제제에 대한 연구가 진행되지 않은 상태이다. 친환경제제의 종류로는 천연물질이나 Bacillus spp. 균주를 활용한 친환경 농약이 있고(Alzoreky and Nakahara, 2003), 딸기의 잿빛곰팡이병, 당귀의 밀 붉은 녹병 발병을 억제하는 등 식물 병원성 곰팡이에 효과가 있다고 보고되고 있는 식물추출물 등이 있다(Kim et al., 2018). Bacillus spp. 균주의 경우 세균의 생육 안정성과 병원균에 대한 항균활성을 나타내어 엽채류등 다양한 작물재배에 있어 생물학적 방제제로 이용된다. 연구사례로는 B. stearothermopuilus를 이용한 상추 균핵병원균에 대한 길항활성작용 검정에 대한 연구보고가 있다(Kim et al., 2008).

농산물에 대한 안전성이 강조되고 있으며, 재배방식에 있어서 친환경제제의 수요량이 증가하면서, 환경친화적 방제법 개발의 필요성이 대두되고 있다(Yeo et al., 2013). 본 연구는 7개의 식물추출물과 길항미생물 B. velezensis UK1의 상추 점무늬병에 대한 균사생장 억제효과를 검정하였다.

재료 및 방법

식물 추출물 선발 및 길항미생물 분리

식물추출물 유기농업자재는 국립농산물품질관리원 유기농업자재정보시스템에서 병해나 병해충 관리용으로 등록되어 있는 제품을 선정하여 사용하였다. 대황(Rhubarb), 피마자 오일(Castor oil), 차나무(Tea plant), 영릉향(Lysimachiae Foenum-Graeci Herba), 계피 오일(Cinnamon oil), 정향나무(Clove tree), 소프넛(Soapnut), 황련(Goldthread) 등 총 7가지의 식물추출물을 선정하였다(Table 1).

길항 미생물의 분리를 위해 충청남도 논산시 성동면 인근의 살균제를 사용하지 않은 상추밭에서 얻은 토양을 15 mL tube에 덜어 넣고 멸균 증류수를 넣고 10^-1－10^-4배의 농도로 희석하였다. 희석한 현탁액을 LB-agar(Duchefa, 네덜란드) 배지에 100 µl 도말한 뒤 28°C에서 1－2일간 배양하였고, 이후 단일 콜로니를 순수 분리하였다. 분리된 미생물들을 A. alternata KL-1(Kim et al., 2021)와 대치배양하여 항균 활성을 보이는 길항미생물을 선발하였다. 1차 대치배양에서 항균 활성을 띈 8개의 길항미생물을 선발하였고, 반복적인 대치배양을 통해 2차 대치배양에서 길항미생물을 최종적으로 선발하였다.

DNA 추출, PCR 및 병원균 동정

선발된 길항미생물을 분자생물학적 방법으로 동정하기 위해 DNA 추출은 Wizard Genomic DNA Purification kit(Promega, USA)를 이용해 추출하였다. 16S rRNA 부분을 증폭하기 위해 universal primer인 27F(5' AGAGTTTG ATCMTGGCTCAG '3)와 1492R primer(5' TACGGYTACCTTGTTACGACTT '3)를 사용하여 서울대학교 농업생명과학공공기기원(NICEM, Korea)에 의뢰하여 염기서열을 분석하였다. 확인된 염기서열은 NCBI(http://www.ncbi. nlm.nih.gov)에서 BLASTN 프로그램을 이용하여 분석하였다.

식물추출물의 균사생장 억제효과 검정

균사생장 억제율 측정을 위해 A. alternata KL-1을 사용하였다(Kim et al., 2021). 병원균의 배양을 위하여 PDA(4 g/L potato infusion, 20 g/L dextrose, and 15 g/L agar)배지에 접종하여 25°C에서 10일간 배양하였다. A. alternata에 대한 식물추출물의 균사생장 억제효과 시험은 우선 멸균한 PDA에 각각의 자재를 10, 100, 1000 µg/mL의 농도로 맞춰서 첨가하여 배지를 만들고, PDA에서 3일간 배양한 A. alternata KL-1의 균총 선단부를 cork-borer로 잘라 배지 가운데 접종하여 25°C에서 4일간 배양하여 균들의 식물추출물에 대한 균사생장 억제율을 측정하였다. 각 실험은 총 3반복으로 3회 실시하였으며, 모든자료의 통계분석은 IBM SPSS Statistics 26.0 software(IBM Co., Armonk, NY, USA)프로그램의 Tukey’s multiple range test를 이용하였다.

균사생장억제율(%)=(1－식물추출물배지에서의균총의직경무처리배지에서의균총의직경)×100

길항미생물의 균사생장 생장효과 검정

B. velezensis UK1을 4 mL LB broth에 접종하고 25°C에서 1일간 190 rpm으로 진탕배양 하였다. 배양 후 배지성분을 제거하기 위해 배양액을 2 mL tube에 각각 분주한 후 5,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 배지성분을 제거하였고, 이후 멸균수로 희석하여 B. velezensis UK1 현탁액을 OD₆₀₀ 1.0으로 조정하였다. A. alternata KL-1 균주는 PDA 배지에서 10일간 배양하여 사용하였다. 대치배양을 하기 위해 LPA(LB 50%+PDA 50%) 배지를 만들어 멸균기로 멸균하였고, 90 mm 페트리디쉬에 분주하였다. 이후 페트리디쉬 중심을 기준으로 정삼각형 꼭짓점의 위치에 cork-borer를 이용해 직경 3 mm의 구멍을 3개 내어 현탁액을 분주할 위치를 지정했다. 곰팡이 선접종을 T+1, 동시 접종을 T+0, 세균 선접종을 T-1로 설정하였다. 설정된 순서에 맞게 10⁰－10^-2배로 희석한 B. velezensis UK1 현탁액을 10 µl 접종하였고, A. alternata KL-1은 cork-borer를 이용하여 균총 선단부를 직경 3 mm 크기로 자른 뒤 배지 중앙에 접종하였다. 5일 후 최초로 균사생장 억제율을 측정한 후 이틀마다 균사생장 억제율을 관찰하여 11일 후에 실험을 종료하였다. 각 실험은 3반복으로 3회 실시하였으며, 모든자료의 통계분석은 IBM SPSS Statistics 26.0 software(IBM Co., Armonk, NY, USA)프로그램의 Tukey‘s multiple range test를 이용하였다.

결과 및 고찰

식물추출물의 균사생장 억제효과

선발한 7개 약제를 이용하여 A. alternata KL-1의 균사생장에 대한 억제 테스트를 수행하였다. 측정한 결과 10 µg/mL의 농도까지는 사용한 모든 식물추출물에서 20% 이하의 균사생장 억제율을 보여주어 큰 효과가 없었다. 100 µg/mL의 농도에서부터 높은 균사생장 억제율을 보여주었는데, Goldthread 80%이 약 72%의 억제율을 보여주어 가장 효과가 좋았다(Fig. 1 and Fig. 2). Lysimachiae Foenum-Graeci Herba 5%, Clove tree 70%, Soapnut 40% + Cinnamon oil 20%는 100 µg/mL의 농도에서 각각 61%, 54%, 54%의 억제율을 보여주어 다음으로 효과가 좋았다(Fig. 2). 반면 Rhubarb 92% + Castor oil 3%는 100 µg/mL의 농도에서 23%의 억제율을 보여주어 다른 식물추출물에 비해 효과가 떨어졌고, (Goldthread + Rhubarb) 7%는 100 µg/mL의 농도에서 0%의 억제율을 보여주어 가장 효과가 떨어졌다(Fig. 1 and Fig. 2). 효과가 상대적으로 떨어졌던 Rhubarb 92% + Castor oil 3%는 대황 추출물을 대부분으로 포함하고 있는데 이러한 결과로 볼 때 대황 성분은 A. alternata KL-1을 방제하는데 있어 다른 성분에 비해 효과가 떨어지는 것으로 판단된다. 가장 효과가 좋았던 Goldthread 80%는 황련 추출물을 주로 포함하고 있는데 A. alternata KL-1을 방제하는데 있어 효과적일 것으로 보인다. 가장 효과가 떨어졌던 (Goldthread + Rhubarb) 7%는 황련과 대황 추출물을 함유하고 있는데 황련 성분의 농도가 낮기 때문에 효과가 떨어진 것으로 판단된다. 마지막으로 Lysimachiae Foenum-Graeci Herba 5%는 중간 정도의 효과를 보였는데, 이러한 결과로 볼 때 적은 농도의 영릉향으로도 A. alternata KL-1의 방제를 효과적으로 할 수 있을 것으로 기대된다.

Fig. 1.

Effect of Goldthread 80% and (Goldthread + Rhubarb) 7% on the inhibition of mycelial growth of A. alternata KL-1.

Fig. 2.

The inhibitory effect of plant extracts on the mycelial growth of A. alternata KL-1. Linear growth of the mycelia was measured at 5 days post-inoculation, and the rate inhibition was compared to those without the fungicide. Each letter on the graphs indicates significant differences according to Tukey's multiple range test at p = 0.05.

국내에서 식물성분을 추출하여 만든 친환경자재를 이용한 식물병원성 곰팡이 방제에 대한 연구가 많이 진행되고 있다. 25 종의 콩과식물 종자에서 추출한 메탄올 추출물로 오이잿빛곰팡이병, 밀붉은녹병, 보리흰가루병등에 대해 80%에 달하는 높은 방제율을 확인한 바 있으며(Lee et al., 1998), 당귀에서 추출한 coumarin계 물질인 imperatorin은 벼깨시무늬병, 벼도열병에 대해 우수한 항균활성이 있는 것으로 밝혀졌다(Ryu et al., 2001). 본 연구에서 가장 효과가 좋았던 황련 추출물은 미나리아재비과의 여러해살이 초본식물로, isoquinolie계 alkaloid인 berberin을 주성분으로 포함하고 있어 항균 효과가 뛰어나다고 알려져 있다(Kim et al., 2018). 식물병원성 진균에서도 인삼 탄저병을 일으키는 Colletotrichum gloeosporioides와 아스파라거스 자색반점병을 일으키는 Stemphylium vesicarium의 균사생장 억제에 효과가 있음이 보고되어 있다(Doh and Kil, 2001; Kim et al., 2019). 반면 상대적으로 가장 효과가 떨어졌던 대황 추출물은 anthraquinone derivatives를 포함하고 있으며, 이는 Staphylococcus aureus 및 Escherichia coli 세균의 생장억제 효과가 있다고 알려져 있다(Cao and Zhao, 2011). 따라서 대황 추출물은 항세균 효과는 있지만 A. alternata에 대한 균사생장 억제효과는 적은 것으로 판단된다. 본 연구를 통해서 황련 추출물이 상추 점무늬병 균사생장 억제에 효과가 크다는 것을 확인할 수 있었고, 이러한 결과를 토대로 추후 상추에서 화학농약을 대체할 수 있는 친환경자재가 많이 쓰일 수 있을 것으로 기대된다.

길항미생물의 동정 및 균사생장 억제 효과

2021년 2월 충청남도 논산시 성동면 인근의 15년 이상 살세균제를 사용하지 않은 상추 재배지에서 채취하여 미생물들을 분리하였다. 분리된 미생물들은 A. alternata KL-1과 대치배양하여 항균활성을 보이는 길항 미생물을 선발하였다. 대치배양한 결과 UK1이 가장 뚜렷한 항균활성을 나타내었고, 16s rRNA(594 bp) 염기서열 분석을 통하여 동정한 결과 UK1 균주는 B. velezensis(GenBank accession OK178287)과 100%의 염기서열 일치를 보여주어 가장 유사하였다.

2번에 걸친 대치배양을 통해 여러 길항 미생물 중 가장 큰 억제 효과를 보여 최종적으로 선발된 B. velezensis UK1과 A. alternata KL-1의 접종 시기에 차이를 두어 세균의 농도를 낮춰가며 대치배양을 실시하였다. 접종 시 T‒1의 경우 세균을 먼저 접종한 것이며, T+0의 경우 세균과 곰팡이의 동시 접종, T+1은 곰팡이를 먼저 접종하였다. OD₆₀₀ 1.0으로 맞춘 세균을 먼저 접종 한 T‒1의 경우 약 47% 정도의 균사생장 억제율을 보였고, 동시 접종한 T+0은 약 35%, 그리고 곰팡이를 먼저 접종한 T+1은 약 15%의 억제율을 보였다(Fig. 3). 이러한 결과로 볼 때 상추에 병이 발병하기 전에 세균을 먼저 처리하는 것이 병 발생 억제에 효과가 좋을 것이라고 사료된다. 가장 좋았던 T‒1 조건에서의 세균 희석농도에 따른 균사생장 억제율 차이는 OD₆₀₀ 1.0(10⁰)에서 46%, 10^-1에서 46%, 그리고 10^-2에서 43%의 균사생장 억제율을 보여 농도에 따른 균사생장 억제효과의 차이는 적은 것을 알 수 있었다(Fig. 4).

Fig. 3.

The inhibitory effect of B. velezensis UK1 on the mycelial growth of A. alternata KL-1. (A) Mycelial agar plugs of KL-1 were placed at the center of LPA(LB+PDA). Ten microliters of a bacterial suspension at OD₆₀₀ of 1.0 were inoculated in the 3 mm holes of the plate. T-1, inoculation of the UK1 at 1 day before inoculation of the KL-1; T, inoculation at the same time; T+1, inoculation of the UK1 at 1 day after the inoculation of the KL-1. (B) Mycelial growth inhibition was measured at 5 days post-inoculation of A. alternata KL-1 with the bacterial suspension. Error bars represent standard deviations of three replicates. Each letter on the graphs indicates significant differences according to Tukey's multiple range test at p = 0.05.

Fig. 4.

The inhibitory effect of B. velezensis UK1 on the mycelial growth of A. alternata KL-1. (A) Mycelial agar plugs of A. alternata KL-1 were placed at the center of LPA(LB+PDA). Ten microliters of B. velezensis UK1 suspension, diluted by 10⁰, 10^-1, and 10^-2 (before dilution, adjusted at OD₆₀₀ of 1.0) were inoculated in the 3 mm holes for the plate. (B) Mycelial growth inhibition was measured at 5 days post-inoculation of A. alternata KL-1 with the bacterial suspensions on LPA medium at 25℃. Error bars represent standard deviations of three replicates. Each letter on the graphs indicates significant differences according to Tukey's multiple range test at p = 0.05.

Bacillus sp.는 간균형의 그람 양성세균으로 bacillomycin, inturin 그리고 surfactin 등 다양한 항생물질을 분비하는데, 이러한 항생물질들은 식물의 생육 안정성과 병원균에 대한 항균활성을 나타내는 것으로 알려져 있다(Han et al., 2015). 실제로 우리나라에는 흰가루병 방제를 위한 Bacillus spp.를 이용한 미생물농약으로 8개 품목이 등록되어있다(Park et al., 2018). 그 중 B. velezensis는 식물병원성 곰팡이에 대한 항균활성 뿐만 아니라 식물생장촉진 효과도 보여주는 길항미생물로 화학 살균제를 대체할 수 있는 친환경 미생물 제제로 주목받고 있다(Rabbee et al., 2019). 본 연구를 통해 상추 점무늬병 역시 Bacillus spp.를 이용한 미생물 농약이 상품화 될 수 있을 것으로 기대된다.

요 약

상추(Lactuca sativa L.)는 현대인들의 식탁에 가장 많이 오르내리는 식재료중 하나다. 인간의 건강과 환경을 위한 농산물의 안전성에 대한 관심이 높아지고 있는 반면 상추에 점무늬병을 일으키는 A. alternata에 대한 안전하고 친환경적인 방제법에 대한 정보는 제한적이다. 따라서 본 연구에서는 7가지 식물 추출물과 길항미생물 B. velezensis UK1을 통해 A. alternata KL-1의 생장 억제효과를 테스트했다. 가장 효과적인 식물 추출물은 Goldthread 80%로 각각 100 µg/mL, 1,000 µg/mL 농도에서 균사 성장억제 효과가 72%, 99%를 보였고, Lysimachiae Foenum-G-Egrai Herba 5%, Clove tree 70%, Soapnut 40% + Cinnamon oil 20%가 뒤를 이었다. 대조적으로 Rhubarb 92% + Castor oil 3%, Cinnamon oil 28% + Tea plant 25% 및 (Goldthread + Rhubarb) 7%는 1,000 µg/mL 농도에서 각각 52%, 40%, 12%의 비교적 낮은 억제효과를 보였다. 또한 위 실험을 통해 효과적인 길항미생물 B. velezensis UK1를 발견했다. OD₆₀₀ 1.0의 세균 현탄액 10 µl를 접종한 결과 A. alternata KL-1 접종 1일 전 B. velezensis UK1을 접종했을 때 균사 성장억제 효과가 약 47%로 나타났다. 본 연구를 통해 식물 추출물과 길항미생물 B. velezensis UK1이 상추 점무늬병 A. alternata를 억제하는데 효과가 있음을 확인했다.