서 론
연구설계 및 방법
공시유충(매미나방) 채집 및 공시약제
공시약제(KEFAMA8) 제조
GC-MS를 통한 해충관리용 유기농업자재(KEFAM8) 주성분 정성 분석
HPLC-UVD를 통한 해충관리용 유기농업자재(KEFAM8)에 대한 주성분 정량분석
엽침지법을 통한 해충관리용 유기농업자재(KEFAM8)의 매미나방 실내 살충효과 평가
땅드릅 포장에서의 해충관리용 유기농업자재(KEFAM8)의 매미나방 약제 방제효과 평가
통계분석
결과 및 고찰
해충관리용 유기농업자재(KEFAM8)의 GC-MS 주성분 정성분석 결과
HPLC-UVD를 통한 해충관리용 유기농업자재(KEFAM8)에 대한 주성분 정량분석 결과
해충관리용 유기농업자재(KEFAM8)의 매미나방 실내 살충효과 평가 결과
땅드릅 포장에서의 해충관리용 유기농업자재(KEFAM8) 매미나방 약제 방제효과 평가 결과
결 론
서 론
최근 지구온난화의 가속화 및 겨울 평균 온도 상승으로 인해 돌발 해충들이 생육하기 적절한 조건 형성하고 생장속도를 가속화시켜 부화시기가 앞당겨지거나 부화량 또한 증가해 농작물에 심각한 피해를 주고 있는 실정이다(An et al., 2018). 특히 농작물과 산림에 피해가 큰 돌발해충은 특정 시기나 장소에 국한되지 않고, 돌발적으로 발생하여 농작물 또는 일부 산림에 피해를 주는 토착해충으로서 농경지, 산림, 주택지 등에 주로 서식한다. 대표적 돌발해충으로 갈색날개매미충, 미국선녀벌레, 꽃매미, 매미나방 등이 있으며, 그중에서 매미나방(Lymantria dispar)은 나비목의 태극나방과의 광식성 해충으로 지리적 특성과 유전적 특징 차이로 북아메리카 및 유럽에 분포하는 Lymantria dispar dispar, 일본, 한국, 시베리아 등에 분포하는 Lymantria dispar asiatica, 일본에만 서식하는 Lymantria dispar japonica로 3개의 아종으로 구분하고 있다(Jeon et al., 2016). 유럽계통의 매미나방에 비해 아시아계통의 매미나방은 활엽수뿐만 아니라 침엽수도 가해할 수 있으며, 암컷 성충의 우수한 비행능력으로 서식지와 기주범위가 넓어 농경지와 산림뿐만 아니라 도심으로 이동하여 막대한 피해를 끼치는 것으로 알려져 있다(Hwang et al., 2021; Kang et al., 2017). 또한 매미나방은 국내 토착 돌발해충으로 지역에 따라 대발생한적이 있는데 2019년 이후 충청도, 경상북도, 경기도 등에서 발생하여 활엽수, 침엽수 등 피해가 막심한 것으로 나타났다(Choi et al., 2021). 이러한 돌발해충(매미나방)을 방제하기 위해 주로 화학농약인 살충제가 사용되고 있으나 돌발해충의 세대가 짧아지고 연간 발생횟수가 증가하여 살충제에 대한 저항성이 높아질 가능성이 크고 이미 Carbamate계, Pyrethroid계 등의 다양한 살충제에 대해 저항성이 발달된 것으로 보고되어 방제에 어려움을 겪고 있는 실정이다(Lee et al., 2014). 화학농약을 이용한 방제 이외에 유기농업자재 허용물질을 이용한 방제법에 대하여 국가적 관심이 증가하였고 일부 식물유래 추출물과 식물성 오일 및 다양한 천연물의 경우 화학적 방제에 비해 낮은 독성을 가지고 있으며 또한 우수한 살충력을 보유하고 있기 때문에 해충방제에 탁월한 것으로 알려져 있다(Lee et al., 2022). 본 연구에서는 위와 같은 천연 식물 추출물들을 활용하여 해충관리용 유기농업자재를 제조하였고, 실내외 매미나방에 대한 방제효과를 평가 및 입증하여 친환경 해충 방제용 유기농업자재로서의 가치를 확인하고자 하였다.
연구설계 및 방법
공시유충(매미나방) 채집 및 공시약제
본 연구에 사용된 매미나방의 경우 충청남도 논산시 벌교읍 사정리 482에 위치한 느티나무, 충청남도 금산군 부리면 현내리 905에 위치한 감나무, 경상남도 합천군 가야만 야천리 280에 위치한 떡갈나무로부터 서로 다른 3곳의 지역에서 매미나방 알집을 채집하였고, 채집 후 실험실내에서 사육하였다. 채집된 알집의 경우 2023년 5월 말경 실온에서 부화를 유도한 바 약 50%가 부화에 성공하였다. 부화된 유충은 2－3령 정도까지 지름 90 mm, 높이 30 mm의 Petri-dish(SPL, Korea)에 온도 25 ± 3°C, 상대습도(RH): 60%, 암조건을 유지하여 1일에 한번씩 신선한 먹이를 제공, 사육하여 본 연구에 사용하였다.
공시약제(KEFAMA8) 제조
공시약제의 경우 한국친환경농자재협회(서울특별시 서초구 강남대로 27 화훼공판장 12-3호)에서 Matrine 0.9% 농도의 고삼추출물(Sophora flavescens Extract) 34.9%, Azadirachtin 700ppm 농도의 님 추출물(Neem extract) 31.6%, Acetic acid 4% 농도의 목초액(Pyroligneous acid) 33.3%, 계면활성제(Polyoxyethylene Sorbitan Monooleate, CAS No. 9005-65-6) 0.2%로 구성 및 제조하였다(Table 1). 본 약제 선정은 2020－2022년 외래해충(꽃매미, 갈색날개매미충 및 미국선녀벌레) 선 방제효과 시험연구결과 고삼추출물 단독처리시 85%, 님 추출물 단독처리시 70% 이상의 효과를 나타냈고, 고삼과 님 추출물 그리고 목초액 3종 조합에서는 90% 이상의 방제효과를 나타내 이를 근거로 본 방제효과 공시약제로 선정하였다.
Table 1.
Composition of the eco-friendly insecticide (KEFAMA8)
GC-MS를 통한 해충관리용 유기농업자재(KEFAM8) 주성분 정성 분석
해충관리용 유기농업자재(KEFAMA8)의 천연추출물 및 식물성 오일에 대한 주성분의 정성분석을 위해 Agilent사의GC-MS(Agilnet-5975C, USA)를 사용하였으며, 컬럼의 경우 30 × 0.25 mm, 0.25 µm 규격을 사용하였다. 캐리어 가스는 헬륨(He)을 사용하였으며, 컬럼 오븐 온도를 50－310°C로 설정 최종 310°C 35분간 등온과정을 진행하였다. MS의 경우 70 eV에서 EIM(Electron Impact Mode)로 분석 후 NIST 라이브러리를 비교 분석하여 해충관리용 유기농업자재의 화학적 조성을 정성 분석하였다.
HPLC-UVD를 통한 해충관리용 유기농업자재(KEFAM8)에 대한 주성분 정량분석
해충관리용 유기농업자재(KEFAMA8)에 함유된 주성분의 경우 유기농업자재 공시(제2020-20호) 기준을 바탕으로 HPLC-UVD(Agilent US/1200, USA)기기를 통해 고삼, 님, 목초액 추출물의 주성분(Matrine, Azadiracthin, Acetic acid)을 정량분석을 진행하였다. 고삼(Matrine) 추출물의 분석조건의 경우 컬럼은 ACQUITY BEH Phenyl (1.7 µm, 3.0 × 100 mm, Waters, USA) 컬럼을 사용하여 Flow rate은 0.5 mL/min 설정하였으며, Detector는 UV detector(UVD) 217 nm에서 검출광을 설정하여 분석하였다. 님 추출물(Azadiracthin)과 목초액(Acetic aicd)은 컬럼의 경우 동일한 150 mm × 4.6 mm규격의 C18컬럼(kinetex 5 µm, Phenomenex , USA)을 사용하였고 컬럼 오븐 온도와 속도는 40 °C, 1 mL/min으로 설정 후 시료용액을 10 µL주입하여 UV detector(UVD)를 통해 Wavelength range를 각각 225 nm(님 추출물), 210 nm(목초액) 조건으로 분석을 진행하였으며, 모든 분석은 3반복으로 진행하였다(MAFRA, 2020).
엽침지법을 통한 해충관리용 유기농업자재(KEFAM8)의 매미나방 실내 살충효과 평가
실내 살충효과 시험은 농촌진흥청고시 농약의 시험기준과 방법에 의하여 엽침지법으로 수행하였다(RDA, 2008). 2－3령기의 매미나방 유충을 직경 90 mm의 Petri-dish(SPL, Korea)에 5개체씩 나누었으며, 느티나무 유엽을 해충관리용 유기농업자재(KEFAMA8)에 무처리구, 250:1, 500:1, 1000:1 비율로 희석하여 1분간 유엽을 침지하였고, 새로운 여과지가 깔린 Petri-dish에 매미나방 유충을 접종하였다. 생육조건은 온도 25°C, 상대습도(RH): 60%, 암조건의 Growth Chamber(JSPC-200C, Korea)에서 사육을 진행하였으며, 최종적으로 3일(72시간) 후 동일한 시간에 생사충수를 조사하여 방제가를 확인하였다(Fig. 1).
땅드릅 포장에서의 해충관리용 유기농업자재(KEFAM8)의 매미나방 약제 방제효과 평가
매미나방에 대한 해충관리용 유기농업자재(KEFAMA8) 방제효과 시험은 느티나무와 잎형태가 유사하고 접종 전 섭식시킨 결과 매미나방이 선호하는 땅드릅 포장에서 진행하였고, 2－3령기 매미나방 유충을 처리구당 10마리씩 접종하였다. 처리약제의 농도의 경우 무처리구, 500:1, 1000:1 희석, 총 2가지의 처리약제 농도를 설정하였고, 1회 경엽살포를 진행하였으며 유충이 밖으로 나오지 못하게 그물망을 설치하였다. 방제효과 기간은 총 3일(72시간)을 확인하였으며, 최종 3일 후 해충관리용 유기농업자재 살포 전과 후를 비교하여 매미나방 유충의 생충수를 조사하였다(Fig. 2).
통계분석
매미나방 약제 방제효과 시험은 모두 3반복으로 진행되었으며, 본 연구결과를 통해 얻어진 평균값과 표준편차는 통계프로그램 SAS 9.4프로그램을 활용하여 다중검정(Duncan multiple range test)을 통해 유의성 검정을 진행하였다(유의수준 P < 0.05).
결과 및 고찰
해충관리용 유기농업자재(KEFAM8)의 GC-MS 주성분 정성분석 결과
해충관리용 유기농업자재(KEFAMA8)의 GC-MS 화학적 성분분석 결과 총 167개의 화합물이 검출되었으며, 그 중 Area 값을 1.0% 이상 나타내는 주요화합물은 총 37개로 나타냈다. 본 연구에서 개발한 해충관리용 유기농업자재는 고삼추출물, 님 추출물, 목초액, 계면활성제로 이루어져 있는데, 목초액의 경우 대부분 유기산으로 이뤄져 있으며, 주성분은 아세트산(Acetic acid)으로 알려져 있는데 본 연구 결과에서도 2.48% Area 값을 나타내며 아세트산이 확인되었다(Hwang et al., 2002). 또한 고삼추출물의 주요 화합물인 ALPHA-MATRINE(19.83%), N-Methylcytisine (1.22%) 역시 검출된 것을 확인하였다(Hwang et al., 2009)(Table 2). 반면 님 추출물의 주성분인 Azadiracthin의 경우 성분분석 결과 검출되지 않았는데 보통 GC의 경우 분쟈량(Molecular Weight)이 500이 넘는 물질은 분석하기 어려우며, Azadiracthin의 분자량(720.7 g/mol)이 높고 끓는 점(792.4 ± 60.0°C)로 높아 확인되지 않는 것으로 판단된다(Choi, 2011).
Table 2.
GC-MS component analysis of KEFAMA8
HPLC-UVD를 통한 해충관리용 유기농업자재(KEFAM8)에 대한 주성분 정량분석 결과
해충관리용 유기농업자재(KEFAMA8)에 대한 HPLC-UVD를 통한 주성분 성분분석 결과 고삼추출물의 주성분인 Matrine의 경우 Retention Time(RT) 7.29분에 0.31 ± 0.00 ppm이 검출되었고, 목초액의 주성분인 Acetic acid는 RT 2.25분에 1.32 ± 0.03 ppm 검출된 것을 확인할 수 있었다. 또한 님 추출물의 주성분인 Azadiracthin의 경우 HPLC-UVD 분석결과 Azadiracthin-B 함량은 RT 7.75분에 61.81 ± 4.21 ppm이 검출 확인되었으며, Azadiracthin-A의 경우 7.66분에 167.47 ± 4.05 ppm이며, Azadiracthin A+B의 함량은 229.28 ± 8.01 ppm으로 나타났다(Table 3). 해충관리용 유기농업자재(KEFAMA8)에 함유된 고삼, 님, 목초액 추출물의 세가지 주성분 모두 투입율 대비 정확성 있게 검출된 것을 확인하였다(Table 1). 고삼추출물에 함유되어 있는 마트린(Matrine), 옥시마트린(Oxymatrine)은 해충에 광범위한 살충효과가 있는 것으로 알려져 있다(Kwon et al., 2022). 또한 님 추출물의 살충활성의 주성분인 Azadiracthin은 4가지 형태(A, B, C, D)를 갖고 있으며 그 중에서 살충활성을 나타내는 Azadiracthin A와 B의 경우 섭식 저해, 산란억제, 곤충생장 조절 등 다양한 작용 기작을 통해 광범위한 해충에 대해 우수한 살충활성을 보유한 것으로 알려져 있다(Kim, 2021).
Table 3.
HPLC-UVD component analysis of KEFAMA8
해충관리용 유기농업자재(KEFAM8)의 매미나방 실내 살충효과 평가 결과
매미나방 실내 살충효과 평가 결과 무처리구의 경우 최종 72시간 접종 후 5마리 중 5마리 모두 생존하여 100% 생존률을 보여 처리구 중 가장 낮은 수준의 방제가를 나타냈고, 250배, 500배 희석의 경우 5마리 중 5마리 모두 사멸하여 100%의 가장 우수한 방제가를 나타내며 처리구 대비 유의적인 차이를 보여주었다. 해충관리용 유기농업자재(KEFAMA8)에 함유된 고삼추출물(Matrine)의 경우 유충에 위독성 및 접촉독성 효과를 갖으며, glutathione-S-transferase과 acetylcholinesterase 활성이 감소되어 나타난 결과로 판단되어진다(Cheng et al., 2020). 1000배 희석 시 13.3% 생존율을 보여주며 250배, 500배에 비해 87.8%의 다소 낮은 방제가를 나타냈는데 이는 농도에 따른 활성 차이로 판단되었다(Table 4). Kowah 등의 연구에 의하면 75% 농도의 고삼추출물을 1000배 희석 후 처리했을 때 72시간 후 매미나방(Lymantria dispar) 유충의 사충률이 71.67%에 나타냈으며, 이는 본 연구보다 낮은 수치를 보여주었다(Kowah et al., 2023).
Table 4.
The effects of KEFAMA8 at different dilutions
| Concentration | Number of larva | Survival rate (%) | Control value (%) |
| Control | 5 | 100 ± 0a | 0 |
| 250:1 | 0 ± 0c | 100 | |
| 500:1 | 0 ± 0c | 100 | |
| 1000:1 | 13.3 ± 11.55b | 87.8 |
땅드릅 포장에서의 해충관리용 유기농업자재(KEFAM8) 매미나방 약제 방제효과 평가 결과
땅드릅 포장에서 해충관리용 유기농업자재의 매미나방 약제 방제효과 시험연구 결과 무처리구의 경우 100% 유충 생충율을 나타내며 0%의 방제가를 보여주었고, 1000배 희석 시 16.7% 생충률을 보이며 무처리구 대비 우수한 방제가를 보여주었다. 또한 500배 희석의 경우 100%의 방제가를 보여주며 처리구간 가장 우수한 살충률을 나타냈다(Table 5). Kim et al.(2009)에 의하면 고삼추출물과 멀구술나무의 혼합추출물로 이뤄진 해충관리용 유기농업자재가 배추좀나방 유충을 95% 이상의 우수한 살충활성을 보여주었는데 이는 본 연구 결과와 유사한 경향을 나타냈다(Kim et al., 2009).
결 론
본 연구에서 개발한 해충관리용 유기농업자재(KEFAMA8)는 님 추출물, 목초액, 고삼추출물로 구성되어 있으며 GC-MS를 통한 정성적 성분 분석결과 목초액과 고삼추출물의 주성분인 아세트산(Acetic acid), 알파-마트린(ALPHA-MATRINE) 등이 확인되었으며, HPLC-UVD를 통해 정량분석한 결과 고삼, 목초액, 님 추출물의 세가지 주성분인 Matrine(0.31 ± 0.00 ppm), Acetic acid(1.32 ± 0.03 ppm), Azadiracthin A+B(229.28 ± 8.01 ppm) 역시 확인되면서 투입율 대비 정확성을 확인하였다. 또한 매미나방 유충을 대상으로 실내 살충효과 평가 결과 200배, 500배 희석 시 100% 방제가를 나타냈으며, 땅드릅 포장에서 약제 평가 결과 역시 500배 희석에서 100% 방제가를 보여주며 실내외 우수한 살충력을 보여주었다. 우수한 살충활성을 나타내는 해충관리용 유기농업자재(KEFAMA8)는 돌발해충(매미나방)을 방제 가능한 친환경 유기농업자재로서의 효능을 입증 및 활용가능성을 확인하였다.
