서 론
재료 및 방법
돌배 추출물(PPE)
실험동물
Disease activity index(DAI) 측정
장기 적출
TNF-α, IL-1β, MPO 분석
조직 병리학적 분석
통계 방법
결과 및 고찰
체중변화
DAI 측정
간 · 비장무게, 대장길이
TNF-α, IL-1β, MPO 분석
조직병리학적 분석
요약 및 결론
서 론
궤양성 대장염(Ulcerative colitis)은 대장 점막층에 궤양이 생기는 만성 염증성 질환으로 증상의 호전과 악화가 반복되며, 혈성 설사, 대변 급박감, 복통 등이 주증상으로 나타나는 대표적인 염증성 장질환(Inflammatory bowel disease, IBD)이다(Liu et al., 2017; Randhawa et al., 2014). 국내 궤양성 대장염 환자수는 지난 10년간 2.32배 증가하였으며, 유병률도 꾸준히 증가되고 있다. 특히, 20–50대 경제활동 인구에서 높은 발병률을 보인다(KASID, 2020). 대장염 발생원인은 아직까지 규명되지 않았으나, 식습관, 흡연 등의 환경적 요인, 박테리아 감염, 유전적 소인, 면역체계의 이상 등 다양한 원인들이 복합적으로 작용하여 발생한다(Goyal et al., 2014; Ramos and Papadakis, 2019). 궤양성 대장염의 표준약물치료는 증상에 따라 아미노살리실산, 스테로이드 제제, 면역억제제, 생물학적 제제가 처방되지만, 대장염은 재발율이 높은 난치성 질환으로 장기치료에 따른 약물 부작용이 나타난다(Ferenczi et al., 2016). 따라서, 장기 처방이 가능한 천연물 소재의 대체 치료제 및 기능성 식품소재 개발의 필요성이 대두되고 있다(Currò et al., 2017). 대장염 질환모델 중 dextran sulfate sodium(DSS) 용액을 경구투여하여 유도하는 대장염은 체중감소, 설사, 혈변, 대장길이 축소, 대장점막 상피세포 손상 등의 임상증상이 대장염 환자와 가장 유사하여 궤양성 장질환 연구에 가장 널리 활용되고 있다(Okayasu et al., 1990; Valatas et al., 2015).
돌배나무(Pyrus pyrifolia Nakai.)는 장미과 배나무 속에 속하는 낙엽 활엽 교목으로 구토, 설사, 해열, 기침 및 가래 효능, 이뇨작용이 있어 전통 민간요법으로 사용되어 왔으며(Song and Ahn, 2002), 과육 껍질과 잎은 변비, 설사, 부종, 버섯중독 치료제로 활용되었다(Peng et al., 2015). 돌배나무 잎 추출물은 페놀 화합물을 많이 함유하고 있어 아토피 개선(Kim et al., 2019), 항균활성(Jin and Sato, 2003), 항산화 및 항염 효과(Sroka et al., 2019) 등 다양한 약리활성을 갖는다. 또한, 돌배 과실은 항진드기 효과(Jeon et al., 2012)와 과실추출액의 젖산균 발효로 GABA 성분을 강화한 연구(Choe and Lee, 2019)가 보고된 바 있으나, 천연물 유래 기능성 소재개발을 위한 효능연구는 미비한 실정이다.
본 연구는 돌배 기능성 소재 개발을 위해 DSS 유도 대장염모델에서 돌배 열매추출물의 항염증 효능을 규명하고자 실험을 진행하였다.
재료 및 방법
돌배 추출물(PPE)
건조돌배와 돌배 발효엑기스(PFE)는 밤바치 농장(강원도, 홍천군)에서 제공받아 사용하였다. 건조돌배는 분쇄기를 이용하여 분말화하였다. 열수 추출물(PWE)과 에탄올 추출물(PEE)은 1 L 추출 플라스크에 돌배 분말 50 g과 10배의 증류수 및 50% 에탄올을 각각의 플라스크에 넣고, 열수 추출은 90°C에서 4시간, 에탄올 추출은 70°C에서 2시간씩 2회 추출하여 여과하였다. 에탄올 추출물은 진공농축기를 이용하여 에탄올을 제거한 후, 열수 추출물과 함께 동결건조를 실시하였다.
실험동물
7주령의 수컷 C57BL/6 마우스를 대한바이오링크에서 구입하여 온도 23 ± 1°C, 습도 55 ± 5%, 12시간 자동명암조절을 유지하는 동물사육실에서 1주간 적응시켰다. 체중을 측정하여 무작위법으로 그룹당 8마리씩 7그룹으로 나누었다. 실험군은 (1) 대조군(Normal control, NC), (2) 대장염 유발군(2.5% DSS), (3) 저농도 열수 추출물 투여군(PWL, DSS + 100 mg/kg PWE) (4) 고농도 열수 추출물 투여군(PWH, DSS + 400 mg/kg PWE), (5) 저농도 에탄올 추출물 투여군(PEL, DSS + 100 mg/kg PEE), (6) 고농도 에탄올 추출물 투여군(PEH, DSS + 400 mg/kg PEE), (7) 돌배 발효엑기스 투여군(DSS + PFE, 5배 희석)으로 나누었다. 돌배 추출물(PPE)과 돌배 발효엑기스(PFE)의 대장염 예방효과를 관찰하기 위하여 DSS 투여 3주 전부터 경구투여를 실시하였다(Fig. 1A). 돌배 추출물과 돌배 발효엑기스는 PBS에 녹여 200 µL용량으로 매일 경구투여를 실시하였고, NC군과 DSS군은 vehicle로 PBS를 경구투여하였다. 급성 대장염은 2.5% DSS(M.W. 36－50 kDa, MP biomedicals)를 멸균 수도물에 녹여 5일간 음용수로 공급하였고, 이후 정제수로 교체하였다. 본 연구의 동물실험은 (재)홍천메디칼허브연구소 실험동물운영위원회 승인(HIMH A20-02)을 받아 규정을 준수하여 수행하였다.
Fig. 1
Effect of PPE pretreatment before DSS treatment on body weight. Mice were treated with 2.5% DSS in their water for 5 days to induce acute colitis. PPE was administrated once per day for 21 days before and during DSS treatment. A: Schematic diagram of animal experiment B: Body weight changes C: Body weight gain. *p < 0.05 vs NC.
Disease activity index(DAI) 측정
DSS 투여 3주 전부터 시료물질을 투여하였고, 주 2회 체중을 측정하였다. 2.5% DSS를 공급하면서 매일 음수량과 체중을 측정하였다. 변상태와 혈변은 ColoScreen Ⅲ (#5071, Helena Laboratories, Beaumont, USA)을 이용하여 측정하였다. 대장염 질병활성지수(DAI)는 Table 1에서 제시한 기준에 따라 체중변화, 변경도, 혈변 상태를 매일 체크하여 4점 척도로 평가하였다(Berberat et al., 2005).
Table 1.
Evaluation of Disease activity index (DAI)
장기 적출
간과 비장을 적출하여 무게를 측정하였다. 맹장부터 직장까지 적출하여 대장길이를 측정한 후, saline으로 대장을 세척하였다. 대장을 2등분하여 proximal colon부위는 swiss rolling 기법으로 말아 10% formaldehyde 용액에 고정하여 hematoxyline and eosin staining(H&E)을 실시하였다. 대장의 middle portion은 액체질소에 급속 동결하여 －80°C에 보관하였다.
TNF-α, IL-1β, MPO 분석
대장조직에 10배의 PBS를 넣고 균질화하여 7,000 rpm에서 20분간 원심분리한 후, 상등액을 사용하였다. TNF-α, IL-1β, MPO(Myeloperoxidase) 농도는 ELISA kit(Cusabio, China)를 사용하여 분석하였다.
조직 병리학적 분석
Formaldehyde 용액에 고정한 대장조직은 파라핀 포매 후 5 µm 두께로 박절하여 H&E 염색을 실시하였다. 조직병리학적 분석은 대장점막조직의 손상, 염증세포의 침윤(infiltration), 점막조직의 궤양(ulceration)정도를 Table 2의 기준에 따라 분석하였다(Jin et al., 2017).
Table 2.
Score of histopathological colitis
통계 방법
실험결과는 Mean ± SEM으로 나타내었고, 통계처리는 GraphPad 7.05를 이용하여 one-way ANOVA로 분석하였다. 투여기간에 따른 체중변화와 DAI 점수는 Two-way ANOVA를 사용하였다. 처리군 간의 유의성은 Dunnett’s multiple range test로 p < 0.05 수준에서 유의성 검정을 실시하였다.
결과 및 고찰
체중변화
DSS를 처리하기 전, 돌배 추출물을 3주간 투여하여 체중변화를 Fig. 1에 나타내었다. 투여 21일째, PEL군과 PFE군의 체중이 NC군보다 유의적으로 감소하였다(p < 0.05, Fig. 1B). 3주간의 체중 증가량은 돌배 추출물 투여군이 대조군에 비해 감소하는 경향을 보였으며, PEL군과 PFE군에서는 유의적으로 체중 증가량이 감소하였다(p < 0.05, Fig. 1C). 일반적으로 과일에 많이 함유되어 있는 페놀화합물은 항산화 활성과 항염증 활성이 높은 것으로 보고되었고(Lee et al., 2013), 대사질환에 대한 보호효과로 임상연구에서 배 섭취량이 증가할수록 체중 증가가 반비례한다는 연구가 보고되었다(Oliveira et al., 2003; Oliveira et al., 2008). 위 보고된 연구들은 본 연구에서 돌배 추출물 장기섭취로 체중감소가 나타난 효과와 일치하였다.
DAI 측정
DSS로 유도한 염증성 대장염 진단을 위해 체중감소, 설사정도, 혈변을 합산하여 질병활성지수(DAI)를 측정하였다. DSS군은 2.5% DSS를 5일간 투여하고 종료한 6일차부터 체중이 급격히 감소하였다(Fig. 2A). PWH군은 8일차 체중감소율이 93.30 ± 3.85%로 DSS군 88.88 ± 4.06% 보다 DSS에 의한 체중감소가 유의적으로 억제되었다(p < 0.001). 마지막 투여일인 9일차에는 돌배 열수 추출물 투여군(PWL, PWH)의 체중감소율이 DSS군보다 유의적으로 낮았다(p < 0.05).
Fig. 2
Effect of PPE on the clinical markers in DSS-induced colitis mice. Mice were treated with 2.5% DSS in their water for 5 days to induce acute colitis. PPE was administrated once per day for 21 days before and during DSS treatment. (A) Percentage change in body weight, (B) Stool consistency, (C) Bleeding score, (D) DAI score, (E) DSS intake. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001 vs NC; #p < 0.05, ##p < 0.01, ###p < 0.001 vs DSS.
DSS군에서 변의 경도는 4일차에 변이 묽어지고, 6일차부터 설사를 시작하였다. 설사는 3일간 지속되었고, 이후 회복되는 양상을 보였다(Fig. 2B). DSS군과 비교할 때, 6일차에 PWL군에서 변의 경도가 유의적으로 감소하였고(p < 0.05), 투여 8일차에는 돌배추출물 투여군에서 모두 현저하게 변의 경도가 개선되었다. 에탄올 추출물 투여군이 열수 추출물 투여군보다 변의 경도개선에 더 효과적이었다.
2.5% DSS 투여 3일차부터 잠혈이 검출되었으며, 투여 4일–5일에는 혈변이 관찰되었다(Fig. 2C). DSS 투여를 종료하면서 혈변지수는 감소하였나, 잠혈은 계속 검출되었다. 투여 9일차에 PEL군의 혈변지수가 DSS군보다 유의적으로 감소하였다(p < 0.05).
체중감소율, 변의 경도, 혈변지수를 합산하여 평가한 DAI 지수는 DSS군이 NC군에 비해 투여 9일차까지 유의적으로 증가하였다(p < 0.0001, Fig. 2D). 위 결과로 DSS에 의한 궤양성 대장염이 효과적으로 유도된 것을 확인할 수 있었다. 투여 6일차부터 돌배 추출물 투여군의 DAI 지수가 감소하였으며, PWH군, PEL군, PEH군, PFE군에서 통계적 유의성을 나타내었다. 음수량은 DSS군이 3.79 ± 0.28 mL로 대조군 3.25 ± 0.40 mL보다 음수 섭취량이 유의적으로 증가하였다(p < 0.01, Fig. 2E).
간 · 비장무게, 대장길이
DSS로 대장염을 유도할 때, 염증에 의한 장기변화를 관찰하기 위해 비장과 대장을 적출하였다. 간 무게는 그룹간 차이를 보이지 않았다(Fig. 3A). 따라서, 대장염 유발 전 투여한 돌배 추출물과 DSS 투여가 간대사에 영향을 주지 않은 것으로 사료된다. 비장 무게는 DSS군이 3.55 ± 0.46 mg/g으로 NC군 2.59 ± 0.31 mg/g보다 37% 유의적으로 증가하였고(p < 0.001), PWL군(2.99 ± 0.44 mg/g)과 PEH군(3.02 ± 0.29 mg/kg)은 DSS 투여로 비대해진 비장의 무게를 현저히 억제하였다(Fig. 2B). 대장길이의 단축현상도 대장염 평가를 위한 마커로 활용된다. DSS군의 대장길이는 5.98 ± 0.3 cm로 NC군 7.00 ± 0.42 cm보다 유의적으로 감소하였다(p < 0.01). PWL군(6.43 ± 0.42 cm, p < 0.05), PEH 군(6.72 ± 0.51 cm, p < 0.01), PEF군(6.93 ± 0.18 cm, p < 0.001)에서 DSS군과 비교하였을 때, 대장길이가 현저히 증가되었다(Fig. 3C).
Fig. 3
Effect of PPE on organ weights and colon length in DSS-induced colitis mice. Mice were treated with 2.5% DSS in their water for 5 days to induce acute colitis. PPE was administrated once per day for 21 days before and during DSS treatment. (A) Liver weight (B) Spleen weight (C) Colon length (D) Colon morphology. **p < 0.01, ***p < 0.001 vs NC; #p < 0.05, ##p < 0.01, ###p < 0.001 vs DSS.
TNF-α, IL-1β, MPO 분석
DSS는 항응고 특성을 지닌 화학적 대장균으로 장의 상피층 내벽을 손상시켜 ROS을 포함하는 염증성 사이토카인을 분비한다(Oh et al., 2013). 돌배 추출물의 항염증 효과를 평가하기 위하여 대장 조직액에서 TNF-α, IL-1β, MPO의 농도를 측정하였다(Fig. 4). 염증성 사이토카인 TNF-α는 그룹간 유의적 차이를 보이지 않았다(Fig. 4A). DSS군의 IL-1β 농도는 46.93 ± 23.04 pg/mg으로 NC군 24.26 ± 5.34 pg/mg 보다 2배가량 증가하였다(Fig. 4B). 돌배 추출물을 투여하였을 때, IL-1β의 증가가 억제되는 경향을 나타냈으며, PFE군은 23.07 ± 14.27 pg/mg으로 NC군과 비슷한 수준으로 회복되었다(p < 0.05). DSS 투여는 대장점막에 호중구 침윤을 유도하여 대장점막의 MPO 활성이 증가하게 된다. 따라서, MPO 활성은 대장염 모델에서 산화적 스트레스와 염증성 마커로 많이 활용되고 있다(Klebanoff, 2005; Wu et al., 2005). MPO 활성 증가는 심각한 염증반응을 나타내는데, 본 연구에서 DSS군의 MPO 활성은 34.60 ± 5.36 ng/mg으로 NC군 24.88 ± 4.22 ng/mg보다 40% 증가하여 DSS투여에 의한 대장염 유발을 확인할 수 있었다(p < 0.01). 돌배 추출물 투여군은 MPO 활성을 현저히 억제하였으며, 억제활성은 PFE군 > PEH군 > PEL군 > PWH군 순으로 나타났다(Fig. 4C). 돌배 추출물의 MPO 억제활성은 열수 추출물보다 에탄올 추출물에서 활성이 크게 나타났다. 돌배 추출물의 MPO 활성 억제는 Qiu et al.(2018)의 연구보고와 같이 돌배열매 껍질에 함유된 다량의 폴리페놀 성분이 갖는 항산화 활성과 항염증 활성에 기인한 것으로 생각된다.
Fig. 4
Effect of PPE on the inflammatory factors in colon tissue from DSS-induced colitis mice. Mice were treated with 2.5% DSS in their water for 5 days to induce acute colitis. PPE was administrated once per day for 21 days before and during DSS treatment. (A) TNF-α (B) IL-1β, (C) MPO. *p < 0.05, **p < 0.01 vs NC; #p < 0.05, ####p < 0.0001 vs DSS.
조직병리학적 분석
DSS 투여시 대장점막의 goblet cell과 crypt 구조의 초기손상이 가속화되면서 점막궤양, 점막고유층(lamina propria)에 호중구의 침윤이 관찰된다(Li et al., 2014). 본 연구에서 대장조직을 H&E 염색하여 광학현미경으로 관찰하였다. Table 2의 기준으로 평가한 DSS군의 병리학적 평가점수는 7.40 ± 1.34이며, DSS군은 장벽의 부종, 점막 crypt손실, 염증세포의 침윤 등 전형적인 염증성 증상이 관찰되었다(Fig. 5). 반면, 돌배추출물 투여군은 DSS군과 비교하였을 때, 병리학적 분석 점수가 현저히 감소하였고, DSS로 유도된 염증성 대장염의 병리학적 특성이 유의하게 개선되었다.
Fig. 5
Effect of PPE on colon histopathological changes in DSS-induced colitis mice. Mice were treated with 2.5% DSS in their water for 5 days to induce acute colitis. PPE was administrated once per day for 21 days before and during DSS treatment once per day. (A) Histopathological score, (B) Representative images of hematoxyline and eosin staining of colon tissue (scale bar = 200 µm). ****p < 0.0001 vs NC; #p < 0.05, ##p < 0.01 vs DSS.
요약 및 결론
본 연구는 돌배 추출물의 대장염 예방 및 개선효능을 평가하기 위해 2.5% DSS 유도 대장염 모델을 이용하여 실시하였다. 3주간 돌배추출물을 사전 투여하였을 때, PEL군과 PFE군에서 체중증가를 유의적으로 억제하였다. DSS로 유도한 대장염 증상의 지표인 체중감소, 설사, 혈변을 포DAI 지수가 DSS군에서 염증반응으로 현저히 증가하였으며, 돌배추출물 투여시 유의적으로 감소하였다. 또한, 대장염의 임상증상인 대장길이 감소와 비장조직의 비대가 돌배추출물 투여군에서 개선되는 효과를 나타내었다. 돌배 추출물은 DSS 유도 대장염 모델에서 증가된 염증성 사이토카인 IL-1β와 MPO 활성을 유의적으로 억제하였다. 돌배추출물 투여군에서는 DSS로 유도한 대장염에서 나타난 장벽손상, 염증세포의 침윤, 궤양 등의 조직병리학적 병변이 개선되었다. 돌배추출물은 DSS유도 대장염 질환에 대하여 염증작용을 억제하고, 대장 점막조직의 손상을 회복하여 대장염의 증상을 완화시키는데 효과적이었다. 따라서, 돌배의 항염증 작용기전에 대한 추가적인 연구를 통하여 염증질환 개선 및 예방을 위한 기능성 식품 소재개발에 활용할 수 있을 것으로 기대한다.
